(SANITIZED)UNCLASSIFIED FOREIGN-LANGUAGE BROCHURE ON INSTITUTE OF BIOLOGY(SANITIZED)

• Document Type: CREST
• Collection: General CIA Records
• Document Number (FOIA) /ESDN (CREST): CIA-RDP80T00246A002900500006-9
• Release Decision: RIFPUB
• Original Classification: K
• Document Page Count: 54
• Document Creation Date: December 21, 2016
• Sequence Number: 6
• Content Type: REPORT

Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
E S K O S LO V E N S K A A K A D E M I E V~ D
CESKOSLOVENSKA
MIKROBIOLOGIE
(;YSLO
6
r~~uo~nusr(
~1~V
~+~ O'er ;?
~S. MIKROBIOL.
PRAHA, PROSINEC 1956 ? STR. 241-288
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
~ESKOSLOVENSKA MIKROBIOLOGIE
IiAREL RERAN, LADISLAV BORECKY, MIKULt~~` BURGER, JOSEF DYR, EVA
HLAVAL~KOVA, C7'IRAD JOHN, J[~N KAROLL~EK, Ji~tf MAC URA, redakcni tajemnik,
JI~f Mt~LEK, JAN NEL~~SEK, glen korespondent SAV PAVOL NEMEC, KAREL RA~KA,
JAROMfR SEIFERT, JAROSLAV ~7TERZL
Chaloupka J.: Protoolyticke enzymy aktinomycety Streptomyces griseus. III. Krtitkodobai produkce
enzyme 241
KockovR-Kratochvilova A., Gebauorova A. a IIrdinovru M.: Studium Hardee-Yuungovho efektti
u kvasiniek. I. Volba vhodnych podmienok 247
Dlatelov~ V. a Nect~sek J.: Vyznam fermentacnich podminek pro produlu+i ~:eui~~ilinu lnn~nirin
Penicillium chrysogenum 51- 20
2.i.;
~evbik V., Podojil M., Kyselov~ M. a Vrtiskova A.: Nove antibiotikum BU 306
263
I~lehla J., Spurny M. a Dostulek b1.: Pou~iti teckovaci reakoe na sirovodik pci sledoviini siranoae~
redukce 267
Spurny M., Dost~lek M. a Ulehla J.: Metoda kvantitativniho stanuvcni desulfurikacnirli balacrii 272
Borecky L.: K ot~zke virusovych receptorov. O elektivnej aglutinabilite syslich erytrocytov. 282
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
L~eskoslovenska
M I K R O B I O L O G I E
rocKr-{k 1. (1956) - c~. 6
Proteolyticke enzymy aktinomycety Streptomyces griseus. III.
Kratkodoba produkce enzymu
JI$.f CHALOUPKA
~eskoslovenek~ akademie vgd, Biologicky ustav, m{lcrobiologickg oddglenf, Praha
f`Leditel ustaw akademik Ivan M51ek
Do~Zo 24. 5. 1956
Hodnocenf tvorby a vyluL~ovanf proteasy i jinych exoenzymu, produkovanych
plfsnismi a aktinomycetami, je velmi obtfzne. Kultivace t~chto mikroorganiamu
probfha n~kolik dnf a b~hem teto doby je enzym neustale produkovan. V kultivaL~nf
tekutinL je inaktivovan (bishem 24 hodin o 40-60 %) a jestlize se menf v prab~hu
kultivace pH zivn~ho roztoku, maze se m~nit i rychlost inaktivace.
Snazili jsme se proto vypracovat takovou metodu produkce enzymu, ktera by bud
odstranila nebo aspon zna~n~ omezila inaktivaci proteasy a doplnovala tak vhodnii
dlouhodobe pokusy.
Material a metody
Kultura a kultivace. Pou~itou kulturu a zpusob kultivace jsme popsali v piede~le pr~ci (Chaloupka
1956).
Analytick~ melody. Proteolytickou aktivitu jsme mgrili na kaseinovgm substr~tg Ansonovou metodou
(Anson 1938), kterou jsme upravili (Chaloupka 1955a). KromS aktivity v kultivabn{ tekuting jsme
zji~tovali i aktivitu v mycelu po jeho rozru~eni autolysou pod toluolem. Mycel, odatiedgny z 10 ml
kultivaL~nf tekutiny, jsme v tomto pifpadb po promytf destilovanou vodou auapendovali v 0,6 ml
5.10-3 M CaC12, ktery atabilisoval enzym, a na povrch suspense jsme pipetou piidali 0,5 ml toluolu.
Zkumavky jsme po uz~tkovb,n{ ulo'~ili do termostatu na 28-30 ?C. Autolysa prob{hale 1-3 dny,
v z~vieloati na et~i?{ mycelu (mlad~f mycel autolysuje pomaleji). Autolysu jsme v~dy provi#dgli v ngkolika
paralelnfch vzorc{ch, ktere jsme v urbitych 5asovych intervalech ru~ili. Toluol jsme opatrng odssfili
a autolys5t dophuli destilovanou vodou na puvodni nebo polovibnf objem. V takto piipravengm vzorku
jsme potom zmSfili obvyklym zpusobem proteolytickou aktivitu. Mgi{tkem skonl;enf autolysy bylo
dosa'~en{ konatantn{ proteasovg aktivity v autolys5t~. Mycel se v prubShu autolysy rozpadl na drobng
zrnit~ materi5.1, obeahuj{ci zbytky vl~ken. Tento zpusob rozbijenf mycelu se n5.m oavgdbil lgpe net jin6
bg'cng pou~cfvan5 melody jako zmrazov5,nf a rozmrazovRnf nebo rozt{rttinf s kyaliL~n{kem hlinitf~cn
(Mc Illwain 1948).
Pfiprava au5iny, barveni preparatu a md~eni pH je popa5,no v piede~lg prhei (Chaloupka 1956).
Pracovni poatup. Aktinomycetu jsme kultivovali 48 hodin na tiepabce ve Waksmanovg pudg B
(Wakeman 1950). Mycel byl po kultivaci odstiedgn ve sterile{ch centrifugabnfch zkumavk5,ch a promyt
sterile{ deatilovanou vodou. Promyty mycel jsme auapendovali ve vhodnem objemu sterilnfho roztoku
5.10-y M CaCiz (mycel z 200 ml kultivabnf pudy ve 100 ml roztoku CaCIQ). Suspenai mycelu jsme pipe-
tovali po 20 ml do 500 ml varnych banbk Sial, obsahujfc{ch 20 ml eterihii vody nebo roztoku '~ivin
(pepton, glukosa), nebo roztoku 2 . 10_g M 2,4-duritrofenolu jako inhibitoru proteosyntesy. Do vbech
bangk jsme potom pi?ipipetovali roztok penicilinu G a atreptomycinu tak, aby konebnt~ koncentrace
penicilinu byla 300 jednotek v ml, atreptomycinu 100 jednotek. Baulcy jsme inkubovali obvykle 24 hod.
na reciprokg tiepabce pii 30 ?C. Potom jsme po kontrole sterility zjistili proteasovou aktivitu ve svrchnf
tekutinS i mycelu. Zji~Eovali jsme i pobSteL~nf aktivitu enzymu v mycelu a su~inu pied i po inkubaci.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Nameiene hodnoty proteolyticke aktivity jsou prum5rem ze 2-4 stanoveni, hodnoty susiny prum~-
rem dvou vzorku. Vysledky piedstavuji typicke hodnoty z lady reprodukovanych pokusu. Proteasova
aktivita je ve vsech pi?ipadech vyja#diena v a . 10_4 miliekvivalentu na 1,0 ml enzymatickeho prepar~itu.
Vysledky
Ve avych pokusech jsme pouzivali k inhibici tvorby proteasy 2,4-dinitrofenolu v koncenti aci l . 10 ~' M.
Pokusn5 jsme si ov5rili, ze tato koncentraco neovlivnila aktivitu nebo stabilitu proteasy a ze ?rcela nebo
aspon znacng brzdila tvorbu enzymu. V tabulce 1 je zachycen vliv 1.10 3 M dinitrofenolu na aktivitu
a stabilitu proteasy. Jakozdrojeenzymujsmepou~Cilifiltratu z zivne tekutiny (WB) po p5tidenni kultivaci
Streptomyces griseus, do niz byl dodatecn5 piid~n roztok CaC12 v konec~ne koncentraci b . 10 a M.
Tento enzymaticky preparat byl potom smichan se stejnym objemem dinitrofenolu (dale DNF) nebo
vody a ulo~ien jednak pri -}- 4 ?C, jednak pievrstven 0,5 ml toluolu v termostat5 pii 37 ?C. Jak vyplyvti
z tabulky 1, DNF nem51 vliv ani na aktivitu (m5i?eno na pocatku pokusu), ani nesni~COVaI stabilitu
enzymu (miSieno po 24 a 72 hod.).
~- 4 ?C H2O
i
T 37 ?C H2O
~ 3 7 ?C DNF
21,2
21,2
21,6
19,3
17,2
`30,8
22,2
15,9 ~
15,8
Pri zjistiovani inhibice tvorby proteasy dinitrofenolem jsme inkubovali suspertsi
mycelu 48 hod. stareho bez nebo s DNF v koncentraci 1.10-s M jednak v termostate,
jednak na trepacce pri 28 ?C. Jak vyplyva z tabulky 2, dodo k produkci enzymu
pouze za vzdusneni, t. j. pTi inkubaci na trepacce. Dinitrofenol v tomto pokusu
inhiboval tvorbu proteasy asi z 87 %.
Tab. 2. Produkce proteasy za autolysy Tab. 3. Tvorba proteas3~ v prvnichp5tihodimicli
Termostat
-
Tiepacka
-
__-- - 0 hod. 5 hod. '
xy
--
----- -'- -
H2O DNF
H2O DNF
-
-
-
Susina v mg~ml
:y5
L,6
2
9
3,2
2,5
3,2
Aktivita ve svrchni
L
,
1
i
3, i
14,5
'3,2
tekutiny
4,3
:~,'3
3
,
2.0
1,5
35,8
5,5
~
Aktivita v mycelu
24,6
34,8
3
3,3
2,1
38,0
8,0
~ ~
Celkova aktivita i
28,9 ~
30,0
Ve snaze omezit inaktivaci enzymu behem jeho tvorby na miru co nejmensi,
snazili jsme se podstatne zkratit dobu, za niz produkce enzymu probiha. Behem peti
hodin (tabulky 3) nedoslo vsak v pritomnosti 0,2% peptonu a 0,2% glukosy k meri-
telne tvorby proteasy.
Prodlouzenim doby inkubace jsme dosahli myritelnyho prirustku proteolyticke
aktivity, a to jak bez pritomnosti substratu, tak i v pritomnosti glukosy nebo
glukosy s peptonem. Dinitrofenol tvorbu proteasy silny inhiboval, resp. vubec
zastavil. V tabulce 4 je zachycena produkce enzymu mycelem, vyrostlym na
Waksmanovy glukoso-peptonove pudy B.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
IIL
P PC N,0 ONP
i
Obr. 1. Vliv media na tvorbu proteasy. P =pep- Obr. 2. Vliv st~ii mycelu na tvorbu proteasy vdes-
ton, G = glukosa, DNP = 2,4-dinitro#enol. Akti- til. vode. Osa x: dny, osa y: maxim~lni aktivita
vita (osa y) v a .10_3 mekv. tyrosinu v 1 ml enzymu v a . 10-a mekv. tyrosinu na 1 mg su~iny.
preparatu (4,0 mg su#iny).
Obdobnym zpusobem reaguje i aktinomyceta, vyrostla na synteticke Krasil'niko-
vove pude (SP 3) se strednim fosforecnanem amonnym jako zdrojem dusiku (obr. 1).
Mycel jsme inkubovali pouze s 0,05 % roztokem peptonu i glukosy, abychom nizkou
koncentraci N i C zamezili nebo alespoli silne omezili druhotny rust.
Pri dlouhodobe submersni kultivaci aktinomycety na prostredi s 1 %peptonu
a 1,5 %glukosy (Vf%B) je nejvice proteasy vylu~ovano do prostTedi pomerne starym
(vic jak 4 dny) mycelem, ktery autolysuje. Chteli jsme si overit, zda i schopnost
produkovat proteasu za autolysy v destilovane vode je vazana na scary mycel.
Mycel, odstredeny po 2-7 dnech kultivace, jsme po promyti destilovanou vodou
inkubovali v destilovane vode na tiepacce a po 24, 48 a 72 hod. zjis~ovali proteasovou
aktivita. Produkci enzymu, vztazenou na 1 mg su~iny, zachycuje obr. 2. Nejvy~si
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
produkce bylo dosazeno mycelem starym 48 hod. a je moznorici, ze schopnost
produkce proteasy za techto podminek je zhruba neprimo ilmerna stari pouziteho
mycelu.
Pro sledovani podminek, za nichz dochazi k tvorbe a vylueovani exoenzymu
plisnemi a aktinomycetami, jsou obvykle dlouhodobe pokusy nedostaeujici, protoze
pri nick dochazi k dosti znaene inaktivaci enzymu v kultivaenim prostTedi. Popsana
metoda kratkodobe produkce proteasy maze slouzit jako doplnek techto dlouho-
dobych pokusu. Jeji pouzitelnost je ovsem omezena na organismy necitlive k bez-
nym antibiotikum (jako jsou prave aktinomycety a plisne), protoze se pri ni pouziva
antibiotik k zamezeni rustu mozne kontaminujici mikroflory. V pokusech bez anti-
biotik jsme meli i pri pokud moznem dodrzovani aseptickych podminek 20-30
kontaminaci, v pTitomnosti penicilinu a streptomycinu nedoslo dosud ke konta-
minaci vubec. Obe antibiotika nemela v pouzitych koncentracich vliv na produkci
proteasy.
Vyhodou metody kratkodobe produkce enzymu ve srovnani a dlouhodobymi kultivacemi je kromL~
kratkeho trvani pokusu i to, ze je mozno aktinomycetu inkubovat v piitomnosti vapnikovych iontu,
ktere enzym vyznacng atabilisuji (Chaloupka 1955a). V normaln~ pouzivane pudg, obsahujici kromb
iontu Cas+ i ionty Mga+ a HP04a-, vypadava totiz v~tsina vapniku ve forms nerozpustneho fosforecnanu
hoiecnato-vapenateho. V kratkodobych pokusech, v nichz pracujeme s mycelem uz vyroatlym, muzerne
fosforeL~nany vypuatit a tak uchovavame hladinu vapniku v prostiedi na dostatecne vysi. pH svrchni
tekutiny bylo po 24 hod. inkubace ve vbech pripadech prakticky totez, takze jeho vliv na inaktivaci byl
ve vsech bairkach stejny.
Prirustek enzymu behem 24hodinove inkubace mycelu se substratem jsme vypo-
eitali po odecteni poeateeni aktivity enzymu v mycelu. Dinitrofenol, ktery je znam
jako inhibitor proteosyntesy (Frantz a sp. 1948, Borsook 1952), zabrzdil v nasich
pokusech tvorbu proteasy z 90-100 %. Zajimavy je jev, ze autolysa aktinomycety
v prubehu pokusu byla v pritomnosti dinitrofenolu podstatne rychlejsi a projevila
se jak znacnym ubytkem susiny, tak i ztratou grampositivity a rozpadem mycelu.
Proteolyticka aktivita byla vsak v techto pripadech podstatne nizsi (az 5 X ), a to
jak v kultivaenim media, tak ve vlaknech aktinomycety. Rozpad mycelu aktino-
mycety nebyl tedy podminen pritomnosti proteasy, ale spice narusenim normalne
probihajicich syntetickych pochodu.
Popsana metoda kratkodobe produkce enzymu je jakousi obdobou podlevani
staticky vyrostleho mycelu nekterych plisni eerstvou zivnou tekutinou, je ovsem
upravena pro pouziti pri submersnim zpusobu kultivace. Ma urcite vztahy i k metode
tvorby enzymu v tkanovych iezech, propraeovane Hokinem (1951a), a dalsimi.
Ma vsak proti tomato zpusobu stadia tvorby enzymu nevyhodu v tom, ze pracuje
s celym organismem, nikoli pouze s ureitym specialisovanym organem. Na pridani
zivin reaguje totiz v nasem pTipade mikroorganismus nejen tvorbou enzymu, ale
i rustem a tak dochazi k tvorbe enzymu podstatne pozdeji nez v tkanovych rezech,
kde vznikaji na priklad vrezech pankreatem lipasa, ribonukleasa, amylasa a proteasy
v meritelnem mnozstvi uz po jedne nebo nekolika hodinach (Hokin 1951b, Schucher
a Hokin 1954, Daly a Mirsky 1953, Rychlik a sp. 1955, Folbergova 1955).
V nasich pokusech dochazelo k tvorbe proteasy i pri inkubaci promyteho mycelu
v destilovane vode bez pridani jakychkoli zivin. Svedci to o tom, ze aktinomycety,
podobne jako grampositivni bakterie, dovede hromadit proti koncentracnimu spadu
ve svych bunkach aminokyseliny (Gale 1947) a vyuziva jich potom k tvorbe enzymu.
Fri dlouhodobych pokusech dochazi k nejvetsi sekreci proteasy do kultivacniho
prostredi az v obdobi autolysy aktinomycety, t. j. obvykle etvrty, paty den a poz-
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
d~ji. Rovn~z aktivita proteasy v mycelu je v tuto dobu nejvy~si. Naproti tomu je
schopnost tvorit proteasu za submersni inkubace v destilovane vod~ vazana na
mlad~f mycel, maxima jams dosahli s pouzitfm mycelu star~ho 48 hod. Nemuzeme
v~ak dosud rici, zda tato schopnost je podmin~na vnitrnfm stavem mycelu (na p~f-
klad obsahem nukleovych kyselin) nebo ruznou koncentraci asimilovatelnych vol-
nych aminokyselin v bunkach.
Promyty mycel aktinomycety Streptomyces griseus tvoif proteasu pii submersni
inkubaci bud v destilovan~ vode nebo v piftomnosti zivin. Produkce enzymu probfha
pouze za vzdu~n~nf a je inhibovana 2,4-dinitrofenolem.
Mycelium, inkubovane v piftomnosti 2,4-dinitrofenolu, autolysuje podstatnis
rychleji nez mycelium, inkubovan~ v destilovan~ vod~, i kdyz obsah proteasy je
v piftomnosti dinitrofenolu podstatn~ niz~f. Mycel, ziskany odstiedZnim po 48 hod.
kultivace na glukoso-peptonove pude, tvori phi submersni inkubaci v destilovan~
vod~ podstatn~ vice proteasy nez star~f mycel.
Kratkodoba Produkce enzymu mute s vyhodou doplnovat dlouhodob~ pokusy,
protoze je phi ni snizena inaktivace proteasy na mfru co nejmen~i.
Za technickou epoluprQci dgkuji Olze Civinovg.
Anson, M.: Estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin. J. Gen. Physiol. 22:79,
1938.
Borsook, H.: Enzymatic peptwde syntheses. Their bearing on protein biosynthesis and thermodynamic
considerations. Symposium sur la biogsngse des proteines. IIe Congr. Intern. de Bioehimie, Paris 1952.
Daly, M., Miraky, A. E.: Formation of proteins in the pancreas. J. Gen. Physiol. 36:243, 1953.
Folbergovti., J.: Vliv iontu na tvorbu lipasy v tka~ovych r"ezech pankreatu. Diplomovh prhee, Praha 1955.
Frantz, J. D. J., Zameenik, P. C., Reese, J. W., Stephenson, M. L.: The efj`ect of dinitrophenol on the
incorporation of alanine labelled with radioactive carbon into the proteins of slices of nornxal and
malignant rat liver. J. Biol. Chem. 174:773, 1948.
Gale, E. F.: The assimilation of amino acids by bacteria. L The passage of certain amino acids across the
cell wall and their concentration in the internal environment of Streptococcus faecalis. J. Gen. Mierobiol.
1:53, 1947.
Hokin, L. E.: The synthesis and secretion of amylase by pigeon pancreas in vitro. Biochem. J. 48:320,
1951 a.
Hokin, L. E.: Amino acid requirements for amylase synthesis by pigeon pancreas slices. Biochem. J.
SO :126, 1951 b.
Chaloupka, J.: Proteolyticks enzymy aktinomycety Streptomyces griseus. ~s. biologie 2:208, 1955 a.
Chaloupka, J.: Tvorba a vylucovcini proteasy aktinomycetou Streptomyces griseus. Diserta5nl prd~ee,
Praha 1955 b.
Chaloupka, J.: Proteolyticks enzymy aktinomycety Streptomyces griseus II. Vliv povahy a koneentraee
dusiku na sekreei proteasy. tbs. mikrobiologie 1:32, 1956.
Mc Ilwain, H.: Preparation of cell-free bacterial extracts with powdered alumina. J. Gen. Microbiol. 2 : 288,
1948.
KrasiPnikov, N. A.: Aktinomycety - antagonists a antibioticks lhtky. pesky pi?eklad, Praha 1953.
Rychlik, J., $vejcar, J., dorm, F.: Sintez proteaz i amilazy v podseludoc~noj seleze myJi in vitro.
DAN SSSR 104:284, 1955.
Sehueher, R., Hokin, L. E.: The synthesis and secretion of a lipase and ribonuclease by pigeon pancreas
slices. J. Biol. Chem. 210:551, 1954.
Wakeman, S. A.: The actinomycetes. Waltham 1950.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
IIpoTeoalitTtlrleclcfte ~xstf~bi afc~r~fioMUueTa Streptomyces griseus. I T I.
IipaTl{ocpouaaB npo~yr{q>3H axsxMa
IO. ~a.:I,oynsu
1Te3fOMe
~TMbITbI kI MHl(eJIHYi JI yiII1CTOP0 Pp H41Ha StrC~lOlIIyCCS gP1S2US 06p a3yeT Hp OTCa3y HpH I'1y 6HHHOli
f{yJIbTHBa1~HI[ Haf{ B ReCTHJIJI1IpOBaHHO ~I BOJ~P,, Taf{ H B Rp HCyTCTBHH HHTaTe?1bHb[% BCIIICCTB, llp0-
j~yIS11iIH 3H3HMa OCyIl{CCTBJIHBTCR TOiIbICO HpH a3pal~flH In IIOJ~aB7IBeTCft 2,4-~{NHHTp O(~1CHOJIOM,
B HpIiCyTCTBHH HOTOpOPO MHI~eJII4 f~t HOJ;BCPI deTCfl aBTOJIH3'y 3H1~iHTCJIbHO CIbICTI)E',E, YeM B jI,eCTHJI7IH-
110~i1HHO~I BOJJ;C, XOTH COAep}f{3HIIe IIpOT0a3bI B Hp HCyTCTBHH 2,4-J{HHHTpO(~eHOJIa ~bIBOeT rOp83~U
HHH{e. MIII(eJIII1i, HOJIVYaeMbI~f HyTCM I[CHTpH(~yPfi~OBdHHH 48-uacoBOi~I KyJIbTypbI II8 rJIfOI{0~30-
HCHTOHHO~f CpeAe, 06pa3yCT HpH PeTyGHHHOYI HIIf{y6aI~HI~I B J~OCTH~ISINpOB1HHO~I BOJ~C rOpa~3J~0 ~OJIbI]IP
HpOTea3bl, `feM 6o~Iee CTBpbI ICI MIII;eJIH1fI. KpaTHOC~O'fHdH H110 J{yHIIHH 9H3fIMa MOiI{E'T CJIyH{flTb
~J~06HbIM J~OHOJIHCHHOM J);JIHTeJIbHbIX OHbITOB, TaH H8H H'pH HeI3 HHaf{THB3I[I4H IIp OTec33bI CHH1f{aeTC51
J;O MHHHMyMtI.
Yroteolytic Enzymes of the Actinomyces Streptomyces griseus. III.
Sho t-term Production of the Enzym
J. Claa,loupka
SnInTriary
On submerged incubation in distilled water or in the presence of nutrients, the washed uycelium of
the actinomyces Streptomyces griseus forms a protease. The enzyme is produced only in conditions of
aeration and is inhibited by 2,4-dinitrophenol. The mycelium incubated with 2.4-dinitrophenol autolyses
far more rapidly than the mycelimn incubated in distilled water, even though the protease content is
considerably lower in the presence of dinitrophenol. The mycelium obtained by centrifugation after
48 hours' culturing on aglucose-peptone medium forms considerably more protease than an older myce-
lium submerged in distilled water. The short-term production of the enzyme is useful for supplementing
long-term experiments, because in this way inactivation of the protease is reduced to the lowest possiblo
degree.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
~eskoslovenska
M I K R O B I O L O G I E
roc~nik 1. (1956) - ~. 6
~tudium Harden-Youngovho efektu u kvasiniek. I.
Vol'ba vhodnych podmienok
ANNA KOCKOVt~-KRATOCHVfLOV~, ANNA GEBAUEROV~ a MARGITA HRDINOV~
Slovenska akademia vied, Chemicky ustav, oddelenie glycidov a biochemie, Bratislava
DoAZo 2. 2. 1956
Pri kvaseni za pouzitia intaktnych susenych kvasiniek, macera~nych ~Eiav alebo
roznych plazmolytik sa pozoruje Harden-Youngov efekt. Je charakterizovany
nahromadenim fosforylovanych esterov cukrov, najma fruktoza-l,6-difosforeL~nej
kyseliny a znizenim kvasenia hlavne po vyL~erpani vol'nej kyseliny fosforeL~nej
a vol'neho cukru.
Harden-Youngovho efektu sa prakticky vyu~iiva u~ dlho k nahromadovaniu fosforylovanych esterov
cukrov a k ich izol~cii, nakoYko i;iste chemick~, synt~za tychto lhtok nie je snadn~. ASkoTvek m~ tento
efekt avoje praktick~ vyu~iitie a bol ~astej~ie ~tudovany, nebola jeho pri~ina dlho objasnen~. Len
v roku 1949 Meyerhof dok~zal experiment4lne, pie priisinou Harden-Youngovho efektu je inaktiv~cia
enzymu ?apyr~zy" - je to fosfat~za, katalyzujuca od~tepovanie dvoch zvy~kov kyseliny fosforeL~nej
od ATP. Doplnil kvasni5ng pripravky, javiace inokedy Harden-Youngov efekt, zemiakovou apyr$zou
a zistil, 'fie obvykly ukaz sa. neobjavil. Dostavil sa, znow, ak sa pridali inhibitory apyr~zy. V citovanej
pr~ci autor dok~zal, ~e vyrobenim enzymatickych kvaani5nych pripravkov ultrazvukom alebo zmraze-
nim sa mdse Harden-Youngovmu efektu predict. Kvasni5n~ apyri#za je r&zne citliv~ u su~enych kvasnic
ako u pripravkov tekutych. Av~ak ani jednotlivg plazmolytik~ nejavila jednotny u~inok. Tolugn patri
k naj5astej~ie pou~ivanym plazmolytikom a preto bol tie~C ~asto podrobeny kritike. Tak Buchateeg
(1942) doporu~uje preane vyaki~a6 vhodnu d~,vku tolugnu, preto~e nemusi p&sobiti v~dy len inhibi5ne,
av~ak mode byti aj neuisinny, alebo mo'ce dokonca aj stimulovaB. Asheshov a Giaja (1923) zistili, ~e
2 % tolugnu zachovr#vaju metabolizmua kvasniiSnych buniek nezmeneny. Meyerhof (1949) docielil
riadnti inhibiciu oktylalkoholom, fenyluret~nom, men#iu potom dodecylalkoholom a najmen~iu digito-
ninom.
Zaoberali sme sa porovnavanim priebehu fosforylacie za pouzitia roznych enzyma-
tickych pripravkov, roznych plazmolytik, ako aj roznych kvasnic. Pri tom sme
venovali blizsiu pozornosE obsahu hydrolyzovatel'n'Tbytok glukozy vid obr. 4, tab. 6.)
Tak ako je k prejaveniu Harden-Youngovho efektu treba inaktivovaE apyrazu,
tak je tiez dolezite, aby pri tom nebola ina,ktivovana fosforylaza, ktora katalyzuje
vstupnu vazbu kyseliny fosforeenej na glukozu, teda hexokinaza. K posudeniu
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
priebehu fosforylacie za su~asnej inaktivacie hexokinazy sme pouzili izotiokyana-
tany. Izotiokyanatany blokuju aktivne skupiny -SH hexokinazy. V prvom pokuse
sme pouzili 0,1 ml 0, 2 % syntetickeho fenylizotiokyanatanu. Fosforylacia site slabo
prebiehala, avsak hydrolyzovatel'ny fosfor si zachoval priblizne rovnakil hladinu
v kazdom base o takej hodnote, ako metafosfore~nany p6vodnych kvasnic (tab. 7).
Z toho mozno usudzovaE, ze esterifikacia vSbec neprebiehala pre dSkladnu inakti-
vaciu hexokinazy. Pri pokusoch mimo ramca tejto prate s alylizotiokyanatanom
sme zistili, ze v niektorych malych koncentraciach posobi drazdivo. Opakovali ame
preto pokus s 0,1 ml 0,01 % alylizotiokyanatanu na 1000 ml zmesi, a to v dvoch
r6znych usporiadaniach: jedna aerie bola nechana najprv prekvasiE a druha male
hned od sameho zaciatku pridany alylizotiokyanatan. Po piatich hodinach bol atano-
veny hydrolyzovatel'ny fosfor. V pokusoch vopred neprekvasenych dosiahol hydro-
lyzovatel'ny fosfor najvyssej hodnoty zo vsetkych robenych pokuoov.
Tab. 8. PrehTad priebehu fosforylacie u r6znych prevadz- Tab. 9. Spotrebovany fosfor v mg % u r6z-
kovych generacii pivovarakych kvasnic, vyjadrene nyeh laborat6rnych generacii pivovarakych
v mg % fosforu kvasiniek
Doba odoberania
Generacia v prev
adzke
Laboratorna
Spotrebovany
vzorky po hodinach
tretia I pieta
siesta
generacia
fosfor
0
775
775 -
--775
-- ~ - _--
1
5..3
1
498
520
530
.
419
2
2
43S
478
528
.
73
3
3
452
414
506
. ~,
4
340
309
502
5
~ 328
5
190
166
309
.
I
Doba
odoberania
vzorky
Anorganicky fosfor
v mg ?/
_ o
Zvy"skova glukoza
v ?/
?
po hodinach
- --
P 1
P 11
I P 17
P 1
I
~ 0
775 ~
775
77b
b
5
-
b
1
372 ~
378
319
2,05
1,96 ~
1,28
2
346
342
299
1,42
1,54
1,66
3
354 ~
337
L95
1,56
1,63
1,82
4
391
392
291
2,15
2,05
1,61
~ 5
408
404
29 7
1,40
1, 78
1,40
6
I
428
410
314
~
2,33
2,01
1,19
K uceleniu nasej orientacie sme vyskusali tiez r6zne prevadzkove generacie pivo-
varakych kvasnic a tiez kmene s r6znou morfologickou a fyziologickou charakte-
ristikou (tab. S). Zda sa, ze pri viac raz nasadenych kvasniciach sa tiez oslabi ich
schopnosE fysforylacie. Opakovali sme tento pokus s eistymi kulturami pivovarakych
kvasnic, pomnozenych v laboratoriu za rovnakych podmienok. Prvu kulttzru sme
vypestovali v prostredi bez anorganickeho fosforeenanu. Tuto fosforom hladoviacu
kultilru sme pomnozovali v sladine z tej istej kmenovej varky. Fosforylaciu sme
hodnotili obvyklym sp6sobom a hodnoty anorganickeho fosforu sme porovnavali.
po piatich hodinach (tab. 9). Pokus ukazuje, ze fosforom vyhladovele kvasnice
javia najvaesiu schopnosE viazat anorganicky fosfor z prostredia. Avsak kvasnice,
vedene uz niekol'ko generacii vo vyzivnom prostredi, vykazujil po rovnakej dobe
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
najmexl~ie mnozstvo organicky viazaneho fosforu. Ich fyziologicka einnosE je
pravdepodobne sustredena na hlb~ie prekvasovanie. To je tiez v suhlase s praksou,
kde sa ukazalo, ze tretia az piata prevadzkova generacia vyhovuje najlep~ie.
V eistych kultilrach, pestovanych v laboratoriu, sme presklz~ali tiez tri typicky
rSzne pivovarske kmene: P 1 (pSvodom z pivovaru v Prahe XVI) ako vel'ke podlho-
vaste bunky, P 11 (povodom z pivovaru v Lounoch) ako male guPate bunky, P 17
(pSvodom z pivovaru v Budejoviciach) ako vel'ke guPate bunky (tab. 10, Kockova-
Kratochvilova, Vavruchova a Novakova 1951). Pokus ukazal, ze najmohutnej~ia
fosforylacia je u kmenov s vel'kymi gul'atymi bunkami a najmensia u kmenov
s bunkami podlhovastymi. Naproti tomu aktivita fosfataz je najvaL~~ia u kmenov
a bunkami ovalnymi a najpomal~ia u kmenov s vel'kymi a gul'atymi bunkami.
Najhlb~ie prekvasuju kmene s vel'kymi gul'atymi bunkami a najslab~ie kmene podl-
hovaste.
V tejto praci sme porovnavali podmienky vyvolania Harden-Youngovho efektu
a ako cieP prate sme sledovali najlep~ie nahromadenie fosforylovanych esterov
cukrov pre izolaene pokusy. Najlepsie sa pri tom osvedL~ila kombinacia intaktnych
su~enych kvasnic s plazmolytikom. Intaktne au~ene kvasnice samy vyvolavaju
nepravidelnosE, ktora sa javi v poloL~ase kvasenia, ako sme zistili pri podrobnej#om
rozbore reagujucej zmesi. Plazmolytikum samo nemusi vzdy vyvolaE Harden-
Youngov efekt. Podarilo sa nam vyvolaE uspokojivy efekt malou davkou izotio-
kyanatanov. Tato davka musi byE tak mala a presne vyskusana, aby nestaeila
blokova$ tiolove skupiny hexokinazy. Tento spSsob sa hodi dobre pre pivovarske
kvasnice, ktore sa pre ten Heel nemusia vysusovat. Izotiokyanatany maju e~te to
vyhodu, ze sa dajli snadno odstraniE zo zmesi pre svoju tekavost, eo ostatne plazmo-
lytika nemajli. Najlep~ia sa hodia pivovarske kvasnice hlboko prekvasujuce, vyprane
a ulozene pod c~istou vodou vo vaniach. Podstupuju to obdobie hladovania foaforom,
eo im umoznuje pri uvedenom postupe fosforylacie rychlej~ie viazaE anorganicky
fosforeL~nan z reakL'nej zmesi. Su vyhodnej~ie ako pekarske kvasnice, ktore hromadia
niekol'ko raz menej hydrolyzovatel'neho fosforu.
Asheahov, I. N., Giaja, J.: Sur la survie de la levure toluenishe. C. R. Soc. Biol. Paris, 89:123, 1923.
Bamann, E., Myrback, K.: Methoden der Fermentforsehung. Lipsko 1941.
Bernhauer, K.: C~arungschemisehea Praktikum. Berlin 1932.
Buehsteeg, W.: fiber den Einflusa and die Wirkungsweise von Toluol auf Bakterienzelle. Zbl. Bakter.
II. 105:209, 1942.
Kockovh.-Kratochvilovh, A.: Praktikum technicke mikrobiologie. Praha 1954a.
Kockovh-Kratochvilovh, A.: Enzymatickh systkmy v glycidovem metabolismu kvaainek. Zbornik zo zjazdu
chemikov, sekcia biochemicko-potravinhrska, Bratislava 1954 b.
Kockovh,-Kratochvilovh, A., Vavruchovh, A., Novh,kovh~, D.: Vyznam eprcivneho pdatovdcni technickych
mikroorganismu. Prumysl potravin 7:305, 1951.
Meyerhof, O.: Further studies of the Harden-Young e,)q'ect in alcoholic fermentation of yeast preparations.
J. Biol. Chem. 180:575, 1949.
Nielsen, R.: Bamann, E., Myrback, K.: Cit. 1941.
Wiame, J. M.: The occurance and physiological behavior of the metaphoaphate fractions in yeast. J. Biol.
Chem. 178:919, 1949.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
I~I,~yxlexlle a~i~elcTa Harden Youug-a y ;[po,lcal{eii. I.
BbI~Op yj{O~HbIX yCTOBNLt
~~. Kor#oea-Ifpamoxeu.rLOea, A. Pe6ayepoea. a M. Tpdunoerr
h e S I0 M C
B HacTOftiue~ pa6ome NccseAosa.nNCb yc.aoBNft aoaHNxxol3exNft af~f~eKTa Harden Young-a, npx Ku-
TopoM xa6sloAaeTCft xaxon.nexxe c~oc~3opNSNpoaaxxbix acTepos caxapoB. HaN6o.nee 6~IaronpNftTxbie
peayJlbTaTbI J{aBadIa KOM6NHaI[Nft HCHapyBICHHbIX CyNICHbIX J{pO}i{?rKC1I C N.IIaaMOJINTNKOM. OT~{HN TOJtb-
KO HCHap yNif',HHbie CynleHble ApOx{x{n BbIabIBaIOT Henp aBNJIbHOCTN, ~I,OCTNraIOIIINe MaKCNMyMa B IIOJIO-
BNHe BpeMCHN 6pox{eHNft. CaM n0 Cef)e nZaaMOJINTNK HOBCE',PJ1;a O~ftaaTenbHO NHaI{TNBNpyeT annpasy.
HaM yJ~aBaJIOCb BbI3BaTb yJ~OBJIeTBOpNTeJlbHbik~ 3(~(~Ie KT Harden YOUng-a C IIO MOII~bFO He6OJIb1IION
~{OabL NaOTNOKNBHaTOB. OJ[HaKO aTa ~[O3a J1;OJIx{Ha (7bITb HaCTOJIbKO MaJla, TiTO6bI OHa HC 6blala CNO-
I;O~Ha 6.nn KNpOBaTb TNOJIOBble rp ynnbl PCKCO KNaHaabI. e~TOT CNOCO~ BNO~'IHG IIpNT'OJ1;CH }~Zft nNRHbIX
upON{x{ei%>, KOTOpbIP, C 2T0~1 IjeJIbIO H0 AyHSHO CyIIINTb. LIaoTNOKxaHaTbl NME'IOT CBIe N TO npCNMy-
II);eCTBO, iITO NX :7e rK0 yCTp axNTb N3 CMCCN BBNJ;y NX JIeTy`Ie CTN, ile PO HCT y OCTa ZbHbIX nJTaaMO-
:RNTNKOB. ~,JIH TOPO, `ITOf"1bI BbI3B1Tb 3(~Il~Ie KT Harden YOUNg-a, OTJINNHO IIO'ySXO;IftT HNiI{HCiIpOjlftlllllC
NNBHble ~['pOx{yi{N ABft rJIyC)NHHOrO C6paH{NBaHNft, xpOMbITbIC Ii XpaHNMbIP, B B.`IHHdX C 9NCTOLI BOJSOI~.
3j(eCb OHN NOJZBepraIOTCft B TetieHNe HeKOTOpOrO BpeMeHN (~OC(~OpHOMy I'O~IOjI;aHNIO, VTO nO3BOTftP,T
ISM ~NpN 3TOM CnOCOhe E~OCf~1OpNJIxpOBaHNft~ 6bICTp PC CRftabIBaTb aHOp PaHN`SCCKN)if I~rOC(~IaT Na [INTa-
TeJIbHO);i CpeJ1,bI, HnBHble ApOx{x{N yJ;Of7HCC, ueM NCKapHble, I{OTOpble HaKai[ZNJ3aIOT B HCCICOJIbKO paa
Mexblue rNAponllaxpyloN>;erocft c~ocf~lopa.
Study of the Harden Young Effect in Yeasts. I.
Choice of Suitable Conditions
A study was made of the conditions of the development of tho Harden Young effect, in which acewuu-
lation of phosphorylated sugar esters occurs. The best has proved to be a combination of intact, dried
yeasts, together with a plasmolytic. Intact, dried yeasts alone produce irregularity-, which reaches its.
peak at the half-time of the yeast fermentation. The plasmolytic alone does not always inactivate apyrasc.
We succeeded in producing a satisfactory Harden Young effect with a small dose of? isothiocyanate..
The dose must, however, be small enough not to cause blocking of the - SH groups of hexokinaae.
This method is very satisfactory for brewer's yeast, which does not need to be dried for the purpose.
Isothiocyanates have the further advantage that they can easily he removed from the mixture because
of their volatility, which is not the case with the other plasmolytics. Deeply fermenting brewer's.
yeast, washed and placed in baths irx clean water, is an excellent medium for producing the Harden
Young effect. It undergoes a period of phosphorus deficiency which, with the manner of phosphory-
lation described, enables it to bind the inorganic phosphorus from the medium more rapidly. It is.
more suitable than baker's yeast, which accumulates several times leas hydrolyzable phosphorus.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
G~eskoslovenska
MIKROBIO?LOGIE
roJnik 1. (1956) - c. fi
Vyznam fermentacnich podminek pro produkci penicilinu
kmenem Penicillium chrysogenum 51-20
VLASTA MATELOVt~ a JAN NEL~[~SEK
Vyzkumny uatav antibiotik, Roztoky u Prahy
Dodo 22. 5. 1956
Produktivita kmene je jednim ze zakladnich c~initelu, ktery rozhoduje pTi vyrobe
antibiotik o vyteznosti fermentaeniho postupu. K slechteni produkenich kultur se
pouziva selekL~nich metod, spojenych zpravidla s aplikaci silne pusobicich einitelu.
Zlikladni kulturou, ze ktere byly postupnc vy~lechtkny vl;echny kmeny, pou~Civang v prumyslove
vyrobg penicilinu, byl kmen Penicilliwm chryaogenum NRRL 1951 (Anderson a ap. 1953, Johnson 1952,
Stauffer a Backus 1954). ~irokcho uplatngni v provozu doily zejmena kmeny Q 176, 49-133 a 51-20,
Stauffer a Backus (1954) uvhdgji produkce 435 j./ml pro kmen Q 176, 1519 j./ml pro kmen 49-133
a 1934 j./ml pro kmen 51-20. Nutno poznamenat,'ce tyto vysledky jsou laboratorni. O produkcni vybi,
kterg bylo dosahovRno jednotlivymi kmeny za provoznich podminek, nelze z literatury ziskat ~iadng
informace. Pouze v posledni prb,ci o penicilinovych kmenech uvtidi Torngvist a Peterson (1954) polo-
provozni vysledky, a to 2000 j./ml pro kmen 49-133; pro kmen 51-20 je udhna produkce o 30 % vy~~i,
V rote 1954 jsme propracovali ve Vyzkumnem ustavu antibiotik podminky pro
fermentaci kmenem 49-133, kterym jsme nahradili predchozi kulturu 47-156453.
Po ziskani kmene 51- 20 bylo nasim likolem vypracovat laboratorni postup fer-
mentace s timto kmenem jako podklad tankove fermentacni technologic. Pri teto
praci jsme krome jinych poznatku, na priklad zahranienich zkusenosti, tykajicich se
zejmena slozeni zivnych pud, vyuzivali vysledku, ziskanych pri vyvoji laboratorniho.
fermentaeniho postupu pro kmen 49-133.
Material a metody
Kmeny a jejich uchovavani. Konservy kmenu 49-133 a 51-20 jsme pi?ipravovali na smcsi zeminy
a pisku a uchovhvali pi?i teplotc laboratoi?e.
Pr"iprava aporov~ho inokula. Konaervu jsme naobkovali na ~ikmy agar ve zkumavice ae aporulabni
pudou S. Inkubacni doba pro kmen 49-133 je pct dnu, pro kmen 51-20 ctyi?i dny. Kultivace probihaly
pii teplotg 25 ?C. Prvni aporulabni generaci (auspensi apor) jsme ockovali Rouxovy lahve se aporulabni
pudou S. Doba a teplota kultivace je obdobn~ jako pii kultivaci prve aporulabni generate. Prvni a dru?
hou aporulabni generaci piechovttivame u obou kmentix pi?i teplotb - 18 ?C 4 tydny.
Technika laboratorni fermeratace. Vegetativni inokulum jsme pi?ipravovali na rotacni ti?epacce
(240 obr./min., prumbr kru~inice 5 cm) v 500 ml varnych baukfich s 80 ml pi?islubne pudy. Inkubabni
doba byla odvislh od u~Citbho fermentabniho postupu. Bauky pro kultivaci vegetativniho inokula jsme
ockovali v'~dy sporovou auspensi z druhe aporulabni generate, vyjma u pokusu, v nich~C jsme sledovali
zhvislost produkce na poctu sporulacnich generaci. Vegetativni inokulum jsme kultivovali pi?i
teplotb 25 ?C. VypLstovancho inokula jsme pou'~ivali zpravidla cerstvbho, maximhlnb 2 dny starcho.
Pii ti?iatupnovc fermentaci jams druhou vegetativni generaci opLt kultivovali na rotacni ti?epacce
v 500 ml varnych banktith s 80 ml inokulabni pudy. K naockovcni druhe vegetativni generate jsme
pou~ivali prvni vegetativni generate po pi?islu~ne dobc kultivace, a to v~Cdy 10 ml na banku. Teplot.a
kultivace byla 25 ?C. Doba kultivace byla odvislri~ od fermentabniho postupu. Prtivg tak jako u prvni
vegetativni generate, pou~ivali jsme i druhe vegetativni generate zpravidla bezproatiedng po dokonceni
kultivace.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Pri fermentaci na rotacni trepacce (240 obr.~min., prumcr kru~nice 5 cm) jsme pou'~ivali 500 ml
varnych bankk se 100 ml prislu~ng produkcni pudy. Doba kultivace byla 4 dny pri teplotc 25 ?C. Pro-
dukcni pudy jsme ockovali 10 % vegetativniho inokula. Vzorky pro stanoveni penicilinu jsme odebi-
rali 3. a 4. den fermentace. Vct~inu fermentaci jsme prov~dcli soubc~inc na reciproke trepacce
(96 kyvu/min. pri deice kyvu 10,5 cm). Technika fermentace je obdobna fermentaci na rotacni trepacce
s tcmito vyjimkami: banky jsme plnili 60 ml fermentacni pudy, inokulum jsme pripravovali na rotacni
trepacce shodnc s inokulem pro rotacni trepacku. Fermentace trvala 6 dnu, pri cem'z vzorky pro stano-
veni obsahu penicilinu jsme odebirali 4. a~C 6. den. Mycelium, ulpivajici na stcnc,ch bankk, jsme smyvali
pravideing ka~Cdych 24 hodin.
Kmen 49-133 slou~il pri zav~dcni noveho fermentacniho postupu pro kmen 51-20 v radc pripadu
,iako kontrola. Jako inokulacni pudy pro kmen 49-133 jsme pou~ivali pudy ST, ze kterg byla ve st~ri
inokula 36 hodin ockovana produkcni puda A I.
~ivncfi proatredi.-. Sporulacni puda S: glycerin 6,0 ml, melasa 7,5 ml, kvasnicni extrakt Yatex 5,0 g,
NaCI 10,0 g, KFIZP04 0,06 g, MgSO4 . 7H2O 0,05 g, Fe2(S04)g . (NHq)zSO4 . 24H2O 0,016 g, CaSO4 .
. 2H2O 0,25 g, roztok CuSOq . 5H2O (1 mg~ml) 0,1 ml, agar Difco 25,0 g, destilovana voda 1000 ml.
pH se neupravuje, doba Sterilisace je 20 minut pri 120 ?C.
Inokulacni puda ST: kukuricny extrakt*) (55 % suf.) 36,5 g, glukosa 40,0 g, CaCOg 2,0 g, smes
soli 4,0 g, vodovodni voda 1000 ml, sojovy olej 0,05 ml na banku. Sterilisace 30 minut pri 120 ?C, pH po
sterilisaci 5,4 a'~ 5,8. Smcs soli: KH2P04 8,75 g, MgSO4 . 7H2O 2,0 g, ZnSO4. 7H2O 0,30 g, MnSO4. 4H2O
0,1 g, NaNOs 52,5 g.
Inokulacni puda Dex: kukuricny extrakt (55 % su#.) 27,2 g, dextrin 60,0 g, vodovodni voda 1000 ml,
sojovy olej 0,05 ml na banku. Doba aterilisace 30 minut pri 120 ?C, pH po sterilisaci 5,4 a~C 5,8.
Inokulacni puda B I: kukuricny extrakt (55 % suf.) 60,0 g, sacharosa 27,0 g, Na2SO4 1,0 g, NaOH
0,4 g, vodovodni voda 1000 ml, sojovy olej 0,05 ml na banku. Sterilisace 30 minut pri 120 ?C, pH po
sterilisaci 5,8.
Inokulacni puda B II: kukuricny extrakt (55 % suli.) 31,0 g, sacharosa 20,0 g, NaN03 3,0 g,
KH2P04 0,4 g, CaC03 4,0 g, MgSO4. 7H2O 0,08 g, vodovodni voda 1000 ml, sojovy olej 0,05 ml na banku.
Sterilisace 30 minut pri 120 ?C, pH po sterilisaci 5,8.
Produkcni puda A I: kukuricny extrakt (55 % su{i.) 38,0 g, laktosa 25,0 g, CaCOy 6,6 g, Na~SO4
0,4 g, fenylacetamid 0,5 g, vodovodni voda 1000 ml, sojovy olej 0,05 ml na banku. Sterilisace 20 minut
pri 120 ?C, pH po sterilisaci 5,8 az 6,2.
Produkeni puda B III: kukuricny extrakt (55 % sus.) 2,0 g, laktosa 38,0 g, arasidova mouka (8 % cel-
koveho dusiku) 23,0 g, CaCOg 5,0 g, MgSO4 . 7H2O 0,09 g, Na2SO4 1,4 g, fenylacetamid 0,5 g, vodovodni
voda 1000 ml, sojovy olej 0,05 ml na banku. Sterilisace 20 minut pri 120 ?C, pH po sterilisaci 6,8 a~ 7,2.
Stanoveni produkce penicilinu. Obsah penicilinu ve filtrovanych vzorcich jsme stanovili plotnovou
difusni metodou pri pou~iti testovaciho kmene Bacillus aubtilis PCI-220 (Hess 1955). Produkci jsme
hodnotili v~cdy prumcrem maxim, dosazenych u ka'cde ze tri bankk v pokusu.
Vysledky
Stabilita kmene 51- 20
Prvnim predpokladem pro praci s kmenem 51- 20 bylo overeni stability kultury.
Kmen jsme vyockovali z piskove konservy na sporulacni pudu S a pasazovali az
do pate generate. Vsechny sporove generate jsme produkcne zhodnotili fermen-
tacnim postupem, vypracovanym pro kmen 49-133. Vysledky jsou uvedeny
v tabulce 1. Kmen 51- 20 je velmi stabilni, nebot vlivem pasazovani nedoslo tem~r
k poklesu produkce.
Tab. 1. Stabilita produkce u kmene 51- 20 pri aporovem pas~,zov+ini. Fermentace byly provedeny
na rotacni trepacce. Vysledky jsou prumcrne hodnoty ze 4 pokusu a jsou vyjcdreny v procentech
kontroly kmene 49 -133.
I. generate
II. generate
IIL generate
IV.generace
V. generate
-- I
j.~ml ~ a~ i
1372 165
-
J?~ml %
1400 168
J?~ml
1580
?o
190
J?~~ ?/o
1461 176
I
J?~ml
1286
%
155 I
*) Vyrazem kukuricny extrakt nahrazujeme termin ?corn-steep" (zahustgna maceci voda odpadajici
pri vyrobc kukuricneho skrobu).
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Prvni, druha a treti generate byly konservovany. Po naockovani konserv na
sporulaL~ni pudu S byly kultury pasazovany az do tieti generate. Vsechny tyto
kultury jsme produkL~ne hodnotili optimalnim postupem pro kmen 49-133 a nezjistili
jsme opt vlivem tohoto pasazovani produkini pokles.
Behem dvou mesicu skladovani sporoveho inokula na pudu S pri teplot~ -{- 5 ?C
i - 18 ?C nedoslo u kmene 51- 20 k poklesu produkce. Prave tak jsme zhodnotili
produk~ni stabilitu vegetativniho inokula, uchovavaneho pri teplote ~-- 5 ?C. Zde
jsme vsak zjistili, ze vegetativni inokulum je velmi citlive na dobu skladovani.
1Vlaximalni mozna doba jeho prechovavani je 7 dni. Pri delsim skladovani klesa jeho
produktivita.
Zpusob pripravy vegetativniho inokula
Jako inokula~ni pudy jsme pouzili pudy ST a Dex, ze kterych jsme oc~kovali
po 24, 36, 48, 54 a 62 hodinach do produk~ni pudy A I. Prumerne hodnoty jsou
shrnuty v tabulce 2. PTi pouziti inokula~ni pudy ST bylo dosazeno vyssi produkce
penicilinu nez pri pouziti pudy Dex. Optimalni stari inokula na pudgy ST je 48 hodin,
na pude Dex 24 hodin. Vzhledem k temto vysledkum jsme proto v daleich pokusech
pouzivali inokulacni pudy ST a vegetativniho inokula stareho 48 hodin.
Tab. 2. Vliv delky kultivace vegetativniho inokula na vy~i produkce pii pouCiti inokulacnich pud ST
a Dex. Fermentace byly provedeny na rotaisni tiepa~ce. Vysledky jsou prumgrne hodnoty ze 4 pokusu
a jsou vyjadieny v procentech kontroly kmene 49-133.
Delka kultivace
___ Inokulacni puda
vegetativniho inokula
h
di
a
h
ST
Dex
v
o
n
c
I___
__('
l.~ml % l.~ml I ?/
24
1285
139
1326 ~
143
36
1375
149
1.138
133
48
1433
155
1261
i
136
54
1325
148
1.288
139
62
1].36 I
122
105:1 I
114
Tab. 3. Vztah mezi produktivitou a mno~stvim pudy ve fermenta~ni ba~5ce. Vysledky jsou prumgrna
hodnoty ze 3 pokusu a jsou vyjadieny v procentech kontroly kmene 49-133.
Mno~istvi pudy
v bance v ml
Vliv mnozstvi fermenta~ni pudy na vysi produkce
Pii kultivacich na rota~ni a reciproke trepa~ce jsme menili mnozstvi fermentaL~ni
pudy A I v 500 ml varnych balikach. Sledovana mnozstvi pudy byla 40, 60, 80,
100 a 120 ml. Pudu jsme o~kovali 10 %vegetativniho inokula ve stari 48 hodin
(inokula~ni puda ST). Vysledky jsou shrnuty v tabulce 3. Pro fermentaci kmenem
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
51-20 na rotacni trepacce je optimalni mnozstvi pudy 120 ml, na reciproke 60 ml.
Na rotacni trepaece probiha kTivka produkce antibiotika v zavislosti na mnozstvi
fermentacni pudy opacnym smerem nez na reciproke trepacce. V dalsich pokusech
jsme uzivali na zaklade techto vysledku pro reclprokou trepacku 60 ml pudy, pro
rotacni z technickych duvodu pouze 100 ml pudy.
Vypracovani fermentacniho postupu pro kmen 51- 20
Po zjisteni zakladnich charakteristik kmene 51-20 jsme prikrocili k vypracovani
fermentacniho postupu. Nejprve jsme vyzkouseli ruzne inokulacni pudy pro prvou
a druhou vegetativni generaci, dale stari vegetativniho inokula a konecne novou
produkcni pudu B III.
Tab. 4. Vliv delky kultivace vegetativniho inokula na vysi produkce pri dvoustupnove fermentaci.
Fermentace byly provedeny na rotacni tiepacce. Vysledky jsou prurngrne hodnoty ze 2 pokusu a jsou
vyj~dieny v procentech kontroly kmeno 51-20 pri fermentacnim postupu ST (48 hod.) - A I.
St~ii vegetativniho inokula
Inokulacni puda B I ~i Inokulacnipuda B II
v hodin~ch
24
1045
85
1071 87
3fi
1355
110
1227 100
48
1259
103 1084 88
Tab. 5. Tiistupnov~. fermentace na produkcni pudy A L Vysledky jsou prumgrne hodnoty ze 3 pokusu
a jsou vyj~dieny v procentech kontroly kmene 51-20 pii postupu ST (48 hod.) - A I.
St~ii vegetativniho inokula v hodinuch
_
Roaacni tiepacka
Reciprok~ tiepacka
___
puda B I I puda B II
-
-- -
T
24
i
24
100
97
3fi
24
98
107
48
24
90
ll6
_ - --
~ 24
-- - --
36
io
~
~ 97
36
36
77
105
48
36
89
~
--
102
-. __
24
48
102
105
36
48
107
118
48
4g
101
108
1. Inokulacni pudy. Pro fermentaci kmenem 51- 20 jsme zhodnotili inokulacni
pudy B I a B II pii pouziti ruzne stareho vegetativniho inokula. Jako produkcni
pudy jsme pouzivali pudy A I. Vysledky jsou uvedeny v tabulce 4. Optimalni stari
vegetativniho inokula, pripraveneho na pude B I, je 36 hodin. Tento postup vsak
neni podstatne vyhodnejsi nez postup dosud pouzivany, t. j. ST (48 hod.) - A I.
Pri pouziti inokulacni pudy B II byla optimalni doba kultivace inokula opet 36 hodin,
avsak ani timto postupem nebylo dosazeno vyssich produkci.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
2. InokulaL~nf pudy pro tifstupliovou fermentaci. Pro pifpravu prve vegetativnf
generate jsme pouzili pudy B I, pro pifpravu druhe vegetativni generate pudy B II.
U t~chto pud jsme hodnotili vliv ruzn~ho starf vegetativnfho inokula na vy~i pro-
dukce pi?i pouzitf produkL~nf pudy A I. Vysledky jsou shrnuty v tabulce 5. Pri
postupu B I-B II-A I pri pouzitf ruzne stare prvnf a druhe vegetativnf generate
nebylo dosazeno (posuzovano zejmena podle vysledku z rota~nf tiepa~ky) v zasad~
vy~~f produkce. Ze zkousenych alternativ byl nejvyhodnisj~f postup, pii kter#ni
se maze uplatliovat ruzne za ruznych podminek fermentace. Poukazali jsme na vy-
znam jednotlivych cinitellz biologickych podminek fermentace na produkeni vysi.
Stanoveni obsahu penicilinu provrid5l J. Hess, fermentace v laboratornich tancfch poloprovozni
skupina Iistavu, vedenA~ Ing. J. Zajibkem.
Anderson, R. F., Whitemore, L. M., Brown, W. F.: Penicillin production by pigment-free molds. Ind. Eng.
Chem. 45:768, 1953.
Hess, J.: Mikrobiologickd stanoveni antibiotik difusni metodou na kovovych plotnkch. Sbirka v8deekye}i
praci Min. zdravotnictvf 6:73, 1955.
Johnson, M. J.: Recent advances in penicillin fermentation. Bull. World Hlth Org. 6 : 99, 1952.
Stauffer, J., Backus, M. P.: Spontaneous and induced variation in selected stocks of the Penieillium chryso-
genum series. Ann. N. Y. Acad. Sci. 60:35, 1954.
Torngviet, E. G. M., Peterson, W. H.: Ef)'ect of oil on penicillin production by two new strains of Penacilliune
chrysogenum. Abstracts of Papers, 126th Meet. Am. Chem. Soc. 16A -17A, 1954.
13JIHFIHLIe yC,JIOBI3i3 I~epMOHTa11HH Ha HpOJ~yKL[YIIO IIOHLII[IIJIJINHa IH'1'aMMOM
Penicillium chrysogenum 51-20
IIpit paapa6oTxe ~Ia6opaTOpxblx npneMOS ~IepMexTauNN A~Ix mTaMMa 51-20 MbI NccJlel{osaJ1I1
oTAenbxble I~axTOpbl, s.nNHloxlxe xa paaMepbl AocTxxtxMO# npoAyxuNx. ITpx naccax{ax aTOro
mTaMMa BnJIOTb J{0 nnTO# CIIOp006paayloH~e# reHepaI~NN Ha nJI0TH0# CpPJ;e yMCHbIIIeHNe Np0-
J(yHL(NN H0 Ha6aIIOAa.nocb. Cnopoo6paayloH~Ne CTaJ{NN HyJIbTypbl MO3KH0 XpaHNTb MaHCxMaJIbHO
B Te`ieHNO 2 McCnI;eB, HO BErOTaTNBHbI# 1nOCUIllm - H8 6onblHe HeJ{eJIN. IIpN (~lepMeHTaI~NN NO
CHOCO6y, KOTOpbI# 6bIJ1 HBMN paapa60TaH paHee xaH ONTNMaJIbHbI~f Aslx NITaMMa 49-133, IIITBMIti
51-20 J{aeT Ha BpaulaloN~e#CII KaYa7IHe B CpeJ{HOM 1316 eA,/MJI, IIpN aTOM CNOCO62 BCreTaTNBHbI#
1nOCUlUm npNrOTOBJIneTCx Ha NHO HyJIxI(NOHHO# CpeAe C rJII0 K030#; A.nn I~epMCHTaI[xN xCnOJIb-
ayeTCx cpeAa TNna JIaHTOaa - KyKypyaHbl# aKCTpaHT, BBOJ{eHNe HOBO PO CnOCO6a c~IepMex-
TauNN noBbicn.no npoAyxuNlo B cpeRxeM Ao 1560 eR./Mr. 3TO cnoco6 Tpex cTynexe#. BereTaTxaxbl#
inoculum npxroTOBnneTCx B AByx rexepauNxx xa cpeAe TNna caxaposa - xyxypyaxbl# axcTpaxT;
(~lepMOHTaI{NOHHax cpeAa 6bIBaeT TNna JIaxT03a - apaXNJ{Hax MyKa - Kyxypy3Hbl)71 3KCTpaKT.
IIpN NapaJIJle.nbHO# cep McHTaI[NN Ha Bpan(aIOn(C1riCH N nOCTynaTeJIbHO# Ka9aJIKaX MbI yCTaHOBNJIN,
~ITO aapa1lNH pa37IN`iH0# NHTOHCNBHOCTN MO}KOT OHaablBaTb paaJIN9HOe BJINHHNC B 3aBNCNMOCTII
OT pa37IN4HbIX yCJIOBN# ~IepMCHTaI[NN. MbI aHaJINaxpOBa.nN 3Ha9eHNe OTJ{eJIbHbIX (11aKTOpO$ 6N0-
JIOPN9P.CKNX yCJIOBN# ~Iep McHTauNN A.nx paaMepOB n07IyYa0M0# npOJ{yKIjNN neHN1~NJIJINHa.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
The Significance of Fermentation Conditions for the Production of Penicillin by the
Strain Penicillium chrysogenum 51- ~p
Summar}'
In developing a laboratory fermentation method for the strain 51- 30, a Study was made of the
individual factors which influenced the attainable production level. By successive transfer of this strain
up to the fifth spore generation on a solid medium, no decrease in production occurred. The aporulated
cultures can be stored for two months at most, the vegetative inoculum for maxunally one week. By
a fermentation method which was originally elaborated as being optimal for strain 49 -133, the strain
Cil-20 produces an average of 1316 ?~ml. using a rotary shaker. With this method, the vegetative
inoculum is prepared on a glucose inoculation medium and the fermentation medium is of the type
of lactose-corn-steep. The introduction of the new fermentation method resulted in an average increase
in production of 1560 ?~ml. This method consists of three steps. The vegetative inoculum is prepared
in two generations on sucrose-corn-steep media, the fermentation medium is of the tj?pe of lactose-pea-
nut flour-corn-steep. In parallel fermentations on a rotary and reciprocating shaker, it was found that
different intensity of aeration can have varying ?ffects under different conditions of fermentation.
The influence of the individual factors of the biological conditions of fermentation on production is
discussed.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
L~eskoslovenska
M I K R O B I O L O G I E
roJr-ik 1. (1956) - ~. 6
Nove antibiotikum BU 306
VLADIMfR ~`EVL~fK, MILOSLAV PODOJIL, MARTA KYSELOVt~ a ALENA VRTI~`KOVt~
t~eskoslovenalcri akademie vgd, Biologick~ ustav, mikrobiologick5 oddSleni, Praha
f~editel uatavu akademik Ivan M~lek
Dodo 28. 4. 1956
Z antibiotik bilkovinneho charakteru, isolovanych z aktinomycet a u~innych na
grampositivni i gramnegativni bakterie, byl v literature popsan pouze aktinomycetin
(Welsch 1937-1947). V nasledujici praci uvadime vysokomolekularni antibiotikum
pravd~podobnis bilkovinn~ho charakteru, liL~inne na grampositivni i gramnegativni
bakterie.
Material a metody
Knaen aktinomycety BU 306 byl isolovAn z pudniho vzorku.
Selekee kmene aktinomycety, laboratorni kultivace a mikrobiologick~ titrace antibiotika jams prov(idgli
podobnym zpusobem jako u antibiotika BU 271 ($evcik a ap. 1956). Kiivka antibiotika BU 306 u difuant
metody mikrobiologickych titraci odpovid~ ki?ivice streptomyoinu v rozmezi 1-4 j./ml.
Pr"iprava aurov~ho preparcitu antibiotika. Antibiotikum BU 306 mu'~eme adaorbovat na aktivni uhl{
pi?i kyaelg, neutr~lni i zbsadite reakci (pH 2-9), elute s uhli okyaelenym methanolem ani amSsf metha-
nolu a benzenu (1 : 1) v~ak nikdy nebyla usp5~n~.
Jeliko~ nebyla v f~hodn~ ani adaorpce na: aktivni uhli ani extrakce organickymi rozpou~tgdly, byly
surov~ prepar~ty antibiotika pi?ipraveny lyofilisaci dialysovanych filtr~t~i bestidenni kultury aktino-
mycety.
350 ml fermentaL~ni tekutiny o pH 7,45 a u5innosti 3.500 j. S./ml (streptomycinovych jednotek) jsme
zcentrifugovali a biry roztok 48 hod. dialyaovali proti destilovang vodg pii teplotg + 2 ?C. Roztok bez
elektrolytu byl lyofiliaovd~n, L~un~ jsme ziskali 440 mg slabg na'Eloutlgho amorfniho prd~ku s $L~innoati
2 000 atreptomycinovych jednotek na mg. Reakce amorfniho prAbku s ninhydrinem byla positivni.
Antibiotikum BU 306 mine byt vysrtL~eno z filtrtLtu kultury po piidtini 60 % (NHa)zSO4.
Elektroforeaa. K elektroforese antibiotika BU 306 jams pou'~ivali papfru zn. Whatman L~. 1 (7,5 em X
X 30em), a to jednak v 0,05 M octanovbm uatoji pH b,2 (265 V, 5 mA, 3 hod.) a jednak v 0,0125 M
fosftitov~m uatoji pH 7,2 (265 V, 2,5 mA, 3 hod.). Jako kontroly pro endosmosu jsme pouEili chloram-
fenikolu a hydrolys~,tu ~Celatiny.
Cytoatatickou uc~innoat jsme zji##ovali metodou podle Yamamoto a Yamaoko (1954) u myl{i s Ehrli-
chovf m ascitick$~m tumorem.
Vysledky a diskuse
Antibiotikum BU 306 jsme ziskali z kmene aktinomycety, uveden~ v nazi sbirce
pod L~islem 306. Kolonie aktinomycety, kter~ jsou vespod rezav~ hn~d~, tvorf na
b~znych agarovych pudach nazloutle sport', pigment do agarov~ pudy neprodukuji.
Puvodni kmen aktinomycety produkoval pri submersni kultivaci na trepa~ce
na pudg uvedene u antibiotika BU 271 (~ev~ik a sp. 1956) 120 j. S./ml (streptomyci-
?novych jednotek). Rozsevem na agarovych pudach t~hoz slozeni jsme ziskali od~tespy
s maximalni produkci okolo 1000 j. S.~ml. Postupnym preo~kovavanim na ~ikmych
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
bramborovych agarech klesala produkce antibiotika z 1000 j. S.~ml az na 300j. S.~mL
Po novem rozsevu na agarove pude jsme ziskali 35 odstepu, z nichz vetsina (27)
produkovala antibiotikum, avsak v mensi mire (100-400 j. S.~ml). Ziskane odstepy
byly dost nestale. Da~lsim rozsevem isolatu, produkujiciho 400 j. S./ml, byly ziskany
32 odstepy, z nichz u 7 byla mnohem vyssi produkce (1000-1600 j. S./ml).
Rozsev aktinomycety BU 306 byl provaden na agarove pude s kukuricnym extrak-
tem (0,5 %), ktera svym obsahem aminokyselin mute predstavovat vhodne prostredi
pro biosyntesu bilkovin (molekulu antibiotika). Jednotlive odstepy jsme uchovavali
na sikmych bramborovych agarech v lednici pri -}- 4 ?C.
Vysokou produkci antibiotika (1500-2000 j. S.~ml) jsme ziskali pri kultivaci na
reciproke trepacce na vyse uvedene pude s kukuricnym extraktem. V nekterych
pripadech byla ziskana maximalni produkce 3500 j. S./ml, a to po 6-7 dnech kulti-
vace.
pH '2,0 ~ pH 7,0 ~ pH 9,0
Zcentrifugovany vzorek _ _
~ streptomycinovych jednotek v ml
Po upravg pH
140
160
148
24 hod. 4 ?C
116
160
115
24 hod. 20 ?C
0
150
53
16 min. 100 ?C
0
0
0
Pri fermentaci ve sklerrenem laboratornim tanku o obsahu 1000 ml jsme dosahli
maximalni produkce 1150 j. S.~ml po 120 hod. kultivace. Laboratorni tank jsme
ockovali vegetativnim inokulem (2 % objemu pudy) z trepacky, starym 24 hod.;
michani 375 ot./min., vzdusneni jeden objem vzduchu za minutu.
Stabilita antibiotika je uvedena v tabulce 1. Pri 2 ?C bylo antibiotikum stale po
nekolik tydnu.
Organicka rozpoustedla antibiotikum rozrusuji. Antibiotikum BU 306 nedialysuje
celofanovou membranous skvrna antibiotika po oddcleni od balastnich latek na
papirovem elektroforegramu se barvi bromfenolovou modri, coz ukazuje na moznost,
ze jde pravdepodobne o bilkovinny charakter molekuly.
Antibiotikum BU 306 je pri difusni metode mikrobiologickych titraci nejucinnejsi
pTi pH 8. Ucinnost postupne klesa s klesajicim pH. 50% krevnim serem je anti-
biotikum inaktivovano z jedne poloviny. Antibiotikum BU 306 ptirsobi na grampo-
sitivni i gramnegativni bakterie. Ucinnost antibiotika je uvedena v tabulce 2. Na
mikroba Mycobacterium phlei pusobi antibiotikum BU 306 priblizne v teehze kon-
centracich jako streptomycin.
Antibiotikum BU 306 neni prilis toxieke. Na protozoa Tetrahymena gelei a Euglena
gracilis nepusobila koncentrace 1000 j.~ml toxicky (filtrat kultury). Toxicita u mysi
zavisela na mnozstvi pritomnych vysokomolekularnich balastnich latek a ne na
koncentraci (ucinnosti) antibiotika. U intravenosnich injekci bylo LD50 0,5 mg~20 g
u lyofilosovaneho preparatu po dialyse s ucinnosti 2000 j.~ml. U preparatu s ucinnosti
800 j.~mg bylo LD50 0,7 mg~20 g, coz odpovida 560 j.~mys a u preparatu s ucinnosti
120 j./mg bylo LD50 1 mg/20 g, coz odpovida 120 j./mys.
Antibiotikum BU 306 pusobilo tez na Ehrlichuv asciticky tumor u mysi. U kon-
taktniho testa, kdy buiiky tumoru byly 3 hod. v lednici s antibiotikem, pozorovano
prezivani myei u davek 125 j.~mys. Zatim co kontrolni mysi s tumorem bez anti-?
biotika hynuly po 12-15 dnech, prezivaly mysi s antibiotikem pies mesic. V pokuse
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
bylo pouzito preparatu s u~innostf 1000 j.~mg. Podobne vysledky jsme pozorovali
u terapeutickych testu s touze koncentracf antibiotika, kdy antibiotikum bylo
podavano jednou denne celkem po osm dni. Antibiotikum bylo podavano intra-
peritonealne a prva davka antibiotika byla vstriknuta za tii dny po nao~kovani
tumoru.
Salmonella typlwsa
S. puratyphi B
S. typhi murium
Shigella paradysenteriae
Sh. alcalescens
Pseudomonas aeruginosa
P. putida
Noeardia asteroides
Q #i
0,5
4
1
0,6
Z vysokomolekularnich antibiotik (bilkovinneho charakteru), ktera pusobf na
grampositivnf i gramnegativni bakterie, je znam u aktinomycet pouze aktinomy-
cetin. Antibiotikum BU 306 se vsak lief od aktinomycetinu jednak stabilitou a jednak
zpusobem isolate. Antibiotikum BU 306 se nevysrazi ani okyselenfm na pH 3-4 po-
moci HCI, ani pridanim 4 objemu alkoholu nebo acetonu.
Antibiotikum BU 306 bylo ziskano z blue neurcene aktinomycety ozna~ene
Leis. 306. Surovy preparat antibiotika je nazloutla vysokomolekularnf latka, ktera
se barvi na elektroforegramu bromfenolovou modif. Antibiotikum pusobf na gram-
positivnf i gramnegativni bakterie a na Ehrlichuv asciticky tumor u mysf.
Toxicita antibiotika zavisf na ~istotis preparatu. U preparatu s uL~innosti
2000 j. S./mg bylo LD60 pTi intravenosnich injekcfch 25 mg/kg.
Antibakterijnfm spektrem a velikosti molekuly se podoba antibiotikum aktino-
mycetinu, od nehoz se vsak lief stabilitou, zpusobem isolate a rozpustnosti v orga-
nickych rozpoustedlech.
SurovB prepartity antibiotika piipravil RNDr L. Novotny v Chemick~m ustavu L~SAV, za co'c mu zde
dbkujeme. DRIe dgkujeme M. Vd~vrov~ a E. Nedbalovt; za technickou apolupr~ci.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
~evbik, V.: Lwod do biochemicke analyst' mikroorganismu. Praha 1954.
~evbik, V.: None antibiotikum BU 271. ~s. mikrobiologie, 1:223, 1956
Welsch, M.: Influence de la nature du milieu de culture sur la production de lysines par les Actinomyces.
C. R. Soc. Biol., 126:244, 1937.
Welsch, M.: De quelques proprreies du principe bacteriolytique des Actinomyces. C. R. Soc. Biol., 126:247,
1937.
Welsch, M.: Mise au point dune technique nephelometrique pour l'etude de la mycolyse. C. R. Soc. Biol.,
128:795, 1938.
Welsch, M.: Dosage nephelometrique du principe bacteriolytique des Actinomyces. C. R. Soc. Biol.,
128: 1172, 1938.
Welsch, M.: Inactivation par la chaleur du principe baeteriolytique des Actinomyces. C. R. Soc. Biol.,
128:1175, 1938.
Welsch, M.: Mise au point dune technique nephelometrique pour l'etude de la mycolyse. II. Influence de la
reaction du milieu sur le trouble des suspensions mierobiennes. C. R. Soc. Biol., 130:797, 1939a.
Welsch, M.: De l'inactivation du principe bacteriolytique des Actinomyces par Zes rayons ultra-violets.
C. R. Soc. Biol., 131:1296, 1939 b.
Welsch, M.: Bacterial substances from sterile culture-media and bacterial cultwres; with special reference
to the bacteriolytic properties of Actinomycetes. J. Baet., 42:801, 1941.
Welsch, M.: Actiyeomycetin. J. Bact., 53:101, 1947.
Welsch, M.: PJaenom~nes d'antibiose chez les Actinomyc~tes. Gembloux 1947.
Yamamoto, T., Yamaoka, T.: A study on the screening method of antitumor substances produced by micro-
organisms. J. Antib., 7A : 7, 1954.
HOBbII3 aHTH~OHOTIIK B[1 ~3OC1
B, lllee~suh, Lb1. IloBou.~, M. I{'uce.zoea u A. Bplnuzu~oea
PE3IOME
AHTNONOTNH BU 306 UbIJI NO7Iyi1EH H3 T09HEE HE OHpET~CTEHHOPO ~'IyYHCTOPO PpN~Kd, OE03H~IYEH-
Ii0P0 HaMN )Y" 306. B CbIpOM BNl~E Nl)EIIap3T 3HTNCNOTNHa NpEj(CT&BJIHET HSEJITOBdTOE HE~ITp BJIbH00
BENIECTBO, BEpOHTHO SESIHOBOrO X7p3HTEpa, AHTNCNOTNH j;E~iCTByET Ha PpdM-NOJIOiKNTEJIbHbIE
N P~aM-OTp NL12TEJIbHbIE C3HTEpNN N Ha aCi[NTHyIO ONyXOJIb c~pJINXa y MbIHIEkI, TOHCN9HOCTb aHTN-
GNOTNHa 3aBNCNT OT CTENEHN `INCTOTbI H1JEN1p7Ta, y Nl)EHapBTa C 3i~I~EHTNBHOCTbIO 2000 ER. C.~MP
NPN BHyTpNBEHHbIX BNPbICHNBaHNRX LD50 SbIJI3. 2S MP/HP. IIO CBOEM3' 3HTN6aHTEpN~IHOMy CHEI{Tpy
H NO pa3MEp&M MOJIEHyJIbI aHTN6NOTNH 67IIi30H H aFfTNHOMNI[ETNHy, OT HOTOpOPO OTdIN>IaETCH
OjjHdHO NO CBOEII 3'CTO$IYNl30CTN, NO CNOCOF)y N30 nHI[NN H HO pflCTBOp NMOCTN B OpraHN`fECHNX
paCTBOpNTE7IHX.
The 1Vew Antibiotic BU 306
1'. ~eve~dk, M. Podojil, M. Kyselovd and A. Vrtiskova,
Summary
The antibiotic BU 306 was obtained from a unidentified actinomyces which was labelled No. 306.
Tlie raw preparation of the antibiotic is a yellowish, neutral substance, probably of a protein character.
The antibiotic acts on gram-positive and on gram-negative bacteria and also on Ehrlich ascitic tumour
in mice. The toxicity of the antibiotic depends on the purity of the preparation. In a preparation with
a strength of 2,000 units S~mg., LDSO on intravenous administration was 25 mg~kg. The antibacterial
spectrum and size of the molecule resemble those of actinomycetin but the antibiotic differs from this
by its stability, the method of isolation and solubility in organic solvents.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
L~eskoslovenska
M I K R O B I O L O G I E
rodr-ik 1. (1956) - 5. 6
Pouziti teckovaci reakce na sirovodik pri sledovani siranove redukce
JIf~f i~LEHLA, MILO~` SPURN' a MILAN DOSTt~LEK
i~stav pro naftovy vyzkum, Brno
Dodo 27. 2. 1956
Proces biologicke redukce siranu v piirodnich vodach je vazan na cinnost desulfu-
rika~nich bakterii. Tento pochod, charakteristicky pro vodg naftovych oblasti
(Bastin 1926, Sturm 1950), je spojen s obohacenim t~chto vod sirovodikem.
Bg~CnS lze usuzovat na intensitu biologicke redukce siranu z mno~stvi sirovodiku, atanoveneho ve
vod~ch analytickymi metodami titraenimi nebo kolorimetrickymi. Spolehlivgj?i obraz vsak ziakeme
sledov5nim aktivity desulfurikaenich bakterii, neboE positivni testy na redukci siranu svgdei o pravdg-
podobne ubasti biologickych pochodu na tvorbg airovodiku ve zkoumanych vod5ch.
Metodika kvalitativniho testov~ni vod na pi7tomnost desulfurikaenfch bakterii spocive, v tom, pie se
analysovane vodg obohati nekterymi ~Civinami a solemi dvojmocneho ~ieleza (Starkey 1948). Po inkubaci
za anaerobnich podminek se projevi piitomnost desulfurikaenich bakterii tvorbou Berne sra~Ceniny sir-
niku ~eleznateho. Podle rychlosti produkce carne sra'~eniny a podle doby, po nf~ poeine, jeji tvorba, lze
usuzovat na mno'lstvi a aktivitu deaulfurikaenich bakterii v studovane vodg. Vysledky ziskane touto
metodou maji jen orientaeni vyznam. Kvantitativni udaje o vyskytu desulfurikacnich bakterii prak-
ticky nelze ziskat ani plotnovou analysou.
Vypracovali jsme proto metodu pro kvantitativni hodnoceni biologicke redukce
siranu ve vzorcich vod, jejiz princip spo~iva ve sledovani produkce sirovodiku
v zavislosti na ease, za podminek optimalnich pro rozvoj desulfurika~nich bakterii.
Material a metody
Kultury a metody kultivace. Ze,kladni kulturu bakterii todu Desulfovibrio jsme zfskali ze sirovodiko-
veho pramene Dudfkovych lezni ve Vizovicich. V pokusech jsme pracovali s hrubg pieeietgnou kulturou.
Metodika kultivace, charakteristiky rustu, optima pH a rH tgchto bakterii byla detailne studov~na
a popsCina (Dost5lek 1956). Pro kultivaci jsme pouEili modifikovaneho lakt?Ltoveho 'livneho roztoku
(Starkey 1948) bez Mohrovy soli: kysely fosforeenan draselny 0,1 %, chlorid among 0,1, chlorid v5pe-
natf 0,01, kryat. chlorid hoieenaty 0,01, siran sodny 0,1, siiicitan sodny 0,02, m1eL~nan amonnf~ 0,35,
kvasnieny extrakt 0,005. Pi?i rozborech vod byly ~iviny rozpouet8ny piimo v analysovane vodg.
'living jsme piidali v dobS, oznaeene za poc5tek pokusu. Anaerobni kultivaci jsme prov{idgli v lekovk~ch
se zabroulien~m hrdlem o obaahu 100 ml. Kultivaeni teplota byla udrEov~na pii 32 ?C.
Stanoveni airovodiku. Pii vliech dynamickych metod~ch, pii nich~C usuzujeme na ziikladb intensity
dalefho rustu na poeet mikroorganismu, puvodng pi?itomnych ve vzorku, je tieba poL~itat se znatnou
variabilitou. PodobnS je tomu i pii sledov5ni siranove redukce. Tato okolnost rozhodovala pii volbe
chemicke metody, ktere, musela byt dostateeng rychl~ a jednoduchR, aby umo'~nila sledovat produkci
sirovodfku v poti?ebnem poetu paralelnich pokusu. Proto'1e redukce siranu vzorkem byla hodnocena na
z5kladg ngkolika bodu, t. j. z prubShu ki~ivky produkce airovodfku v zevisloati na ease, nebyla vy'lado-
v5na od jednotliveho stanoveni maxim~lni piesnost.
Uvedenym podmink~m nejlepe vyhovovala be~ne teL~kovaci reakce sirovodiku na filtraenim papii?e,
impregnovanem octanem olovnatym, pii ni'1 se tvoiti vyrazn~, L~ernohngd~ sra~Cenina sirniku olovnateho.
Pro teckovaci reakci jsme pou'lili roloveho filtraenfho papiru n. p. Dievona Hronov. Archy o rozmgrech
22 X 30 em byly ponoieny do L~erstvg piipraveneho, nasyceneho roztoku octanu olovnateho a vysu-
seny (pii pou~itf star~fch, zasobnfch roztoku vznikajl se sirovodikem skvrny nestejnomgrng zbarvene,
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
coz zt~~CUje jejich hodnoceni). Zkoumany vzorek jsme nakapa ali mikropipetou v'cdy v konstantnirn
mnozstvi 0,02 ml. Koncentraci sirovodiku ve vzorcich jsme stanovocali visu~lnim srovnanim se ~k~,lou
Standardu obsahujicich 10 a~ 1 i0 ?g H2S~m1. Standardy jsme pripravili nakap~vanim ruzn~redL~ne
kultury desulfiirikacnich bakterii v zivnem prostiedi bez sii?icitanu. Obsah sirovodiku v jednotlivych
redisnich jsme stanovili primou jodometrickou titraci. Abychom nemuseli pTipravovat v~dy nove
Standardy - skvrny sirnilcu olovnateho casem pon~kud zesv~tlaji - peipravili jsme podle standardii
permanentni barevnouskalu, podle niz jsme hodnotili vsechny skvrny.
Vysledky
Tabulka 1, ktera zahrnuje hodnoceni 34 skvrn, ziskanych pri sledovani biologicke
redukce siranu ve dvou zkoumanych vodach; ukazuje reprodukovatelnost hodnoceni
sirovodikovych skvrn. Vysledky hodnoceni skvrn dvema pracovniky se lisily v pru-
meru o 8, 7 %.
Sloupce A a B obsahuji prtixmery tiikrat opakovaneho visualniho hodnoceni tych'c skvrn dv~ma pracov-
niky. Skvrny zisk~ny nakapavanim kultur desulfurikacnich bakterii z piirodnich vod. Hodnoty v tabulce
udavaji Fcg H2S~m1
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Popsanou metodou jsme sledovali produkci sirovodiku v pre~istisnych kulturach
desulfurika~nich bakterii phi ruzn~ velkem inokulu. Tri dny stars kultura byla po
odstied~ni dopln~na do puvodniho objemu zivnym roztokem a z ni byla pripravena
zied'ovaci Tads. Produkci sirovodiku v zavislosti na base a velikosti inokula, ukazuje
tabulka 1 a obr. 1.
Tab. 2. Hodnoceni produkce sirovodiku v kultur~ch desulfurika6nich bakterii pii ruzn6 velk6m inokulu
(viz obr. 1). D = i?6dovy po6et desulfurika6nich bakterii v 1 ml. - Hodnoty v tabulce ud~vaji ?gHZS~mI
16,0 i 45 ~
-
24,0 i 66
25
29,5
100
65
40,5 !
170
115
49,0
> 170
170
64,6
-
-
72,0
-
-
92,5
- ~ -
lOQO i
----
- -
I
-' -
Na obr. 1 je zrejma zavislost mezi Tadem zred~ni inokula a casem, po nemz dochazi
k produkci sirovodiku. PTi aplikaci teto metody je tTeba dbat na okolnost, ze inten-
sity siranove redukce nemusi zaviset pouze na poc~tu a na ?aktivite" desulfurikac~nich
l:i
-
_
AO
16
-
-
135
SO
20
;i
> 170
150
115
70
-
> 170
150
l l:i
-
~
> 170
l70
- ~
-
-
> 1711
z~
- -
--
!. M
? *,
~
?
~
Obr. 1. Puvodui z~znam produkce sirovodiku v kultur~ch desulfurika6nich bakterii pci ruzn6 velkgm
inokulu. D = i?adovy po6et desulfurika6nich bakterii v 1 ml.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
bakterii ve vzorku, ale i na ostatnich slozkach mikrobni populace, jejichz pri-
tomnost se maze projevit budto stimulaci (Starka 1951), nebo i inhibici (Spurny,
Dostalek a T~lehla 1956) produkce sirovodiku. Popsana metoda je vyhodna svou
pruznosti, protoze dava beze zmeny postupu kvantitativni informace o produkci
sirovodiku i pro inokula, lisici se velikosti o sest radu.
Tato vshoda vynikne zejmena pi?i porovnani s plotnovsmi metodami, jejichz pouziti je pro stanovcni
desulfurikacnich bakterii samo o sobg problematicke (Grossman a Postsgate 1953). Plotnove metody
dovoluji atanovit piesng pocet mikroorganismu jedinl; pi?i takovem zi?ed~ni vzorku, kdy na jednotku
povrchu pi?ipada urcits, xizce vymezeny pocet zarodku. Tuto podminku je mono dodrzet, jestli~e zname
alespon iadovg pocet mikroorganismu ve vzorku, jinak je ti?eba predbi;'zng jej stanovit nebo pi?ipravit
celou serif ploten pro ruzna i?ed5ni. Oboji je velmi nevyhodne pii stanovcni desulfurikacnich bakterii
v pi?irodnich vodach, kde se jejich pocet mu~Ce pohybovat xnezi l0i a~ 108 v 1 ml (Spurny, Dostalek
a >'7lehla 1956).
Vcnovali jsme proto samostatnou praci pouziti popsane metody pro sledovani biologicke redukce
siranu k pi?imemu stanovcni poctu desulfurikacnich bakterii ve vodach mineralnich pramenu. (Spurns,
Dostalek a i~lehla 1956).
1. Pri stadia biologicke redukce siranu jsme sledovali produkci sirovodiku tecko-
vaci reakci na filtraenim papiie nasycenem octanem olovnatym.
2. Teckovaci metodou se stanovi sirovodik v mezich 10 az 170 ,ttg H2S~m1. Hodno-
ceni skvrn dvema pracovniky se lisila v prumeru o 8,7 %.
3. Poukazujeme na moznost vyuziti popsane metody pro stanovcni poetu desulfil-
rikacnich bakterii v mineralnich vodach.
Bastin, E. S.: The presence of sulphate reducing bacteria in oil field waters. Scionee 63:21, 1926.
Dostalek, M., Spurny, M.: Kultivacni charakteristiky desulfurikacnich bakterii z naftovyeh lozisek. ~:~.
mikrobiol. 1 : 158, 1956.
Grossman, J. P., Postagate, J. R.: Cultivation of sulfate reducing bacteria. Nature 171:600, 1953. r
Spurny, M., Dostalek, M., i~lehla, J.: Metoda kvantitativniho stanovcni desulfurikacnich bakterii. l'F.
mikrobiol. 1 :272, 1956.
Starka, J.: Nove poznatky o mikrobifilni redukci sulfatac. Biol. listy 32:108, 1951.
Starkey, R. L.: Characteristics and cultivation of sulphate reducing bacteria. Am. Water Works Asso~~.
40:1921, 1948.
Sturm, L. D.: Materialy po mikrobiologiceskomu issledovaniju neftjanyeh mestorozdenij Vtorogo Baku.
Trudy In-ta nefti 1:97, 1950.
IIp1lMeuexHe Toue>axoH pealcuHU xa ceposoRopoR npl~ i7ccale;~oBax111i
6HO~orHUecxoro BoccTarlosnexusi cvnb~aTOB
I~Iay~IaH o'NO~IOrN~Iecxoe aoccTaxoB.nexile cy.~b~iaTOS, aBTOpbi Iicc~eAosasil Bbl~ealexile ceposoAo-
pOAa C NOMON;bIO TOiI0iIH0~ peaKuNN Ha (~IN7IbTpOBaJIbHO~f 6yMare, NpONNTaHHO~I al~eTaTOM CBNHI;a.
C NOMOII;bIO TaHOPO KaNeJIbHOrO MCTOJ{1 ONpeAeJleHNe CP.pOB0A0pOJ[a B03MOHiHO B IIpe~enaX OT 10 J{O
1~0 flP 11 yS~MJI. P03yJIbTaTbI OI~eHKN OTl{eJIbHbIX NHT2H jI,ByMH NCCJIel~OBflTCJIHMN, pa~OTaBNINMi[
HeBaBNCNMO ApyP OT Apyra, paCXOII,NJINCb ji Cpel~HEM Ha g,~%, OTMe'iaeTCH B03MOHtHOCTb NCHOJIb-
$OBaTb 3TOT McTOR l.~JIH OHpej{eJIHNH KOJINYeCTBa j;eCyJlbl~ypNpyiON~NX C~aKTP.pN~i B MNHepaJlbHbIX
BoAax.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Biological Sulphate Reduction as Studied by means of the Spot Test Reaction
for Hydrogen Sulphide
,T. Z~lehla, M. Spurny and M. Doalalek
S u m m a r y
The biological reduction of sulphate was studied by means of the spot test reaction for hydrogen
sulphide on filter paper impregnated with lead acetate. With the method described, hydrogen sulphide
can be estimated in a range of 10 -170 g/ml. The evaluation of spots by two workers differed on an average
by 8.7 %. Attention is drawn to the possible application of this method to the estimation of the number
of sulphate reducing bacteria in mineral waters.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
G~eskosloveM12ska
M I K R O B I O L O G I E
rocnik 1. (1956) - c. 6
Metoda kvantitativniho stanoveni desulfurikacnich bakterii
MILO~` SPURNI', MILAN DOSTt~LEK a JI>~f iTLEHLA
rJstav pro naftovy vyzkum, biochemicke oddcleni, Brno
Doslo 3. 3. 1906
Vyskyt sirovodiku v hlubimiych vodach naftonadejnych oblasti nevi dosud zcela
vyjasnenym problemem. Vedle nazoru, ktery predpoklada jeho anorganicky puvod
(Gartner 1929, Mahel 1952), jsou teoreticke i experimentalni podklady pro domnenku,
ze tvorba sirovodiku ve vodach techto oblasti je vazana na biologickolz redukci
siranu cinnosti desulfurikacnich bakterii.
Tato skupiny byla nalezena prakticky vzdy ve vodach naftovych oblasti (Gahl a Anderson 1928,
Ginzburg-Karagiceva 1933, Isacenko 1940, Sturm 19;10, Ekzercev a Kuznccov 1954) a v sirovodikovych
vodach naftarradcjnych oblasti (Spumy a Dostalek 1956). Vysledky mikrobiologickych testa na pi?i-
tomnost aktivnich bakterii teto skupiny v mineralnich sirovodikovych prarnenech rnohou poskytnout
zava~ny material pro rozhodnuti, zda pi?i nalezech sirovodiku ve vodach je opravncncjsi vyklad jeho
vzniku biologickou redukci siranu ci ?rda jde o proces anorganicky. Po doplncni kvalitativnich testir
kvantitativnimi irdaji o poctu desulfurikacnich bakterii ve studovanych vodach bylo by rnozno srovnat
nalezene potty zarodktir s analytickymi daty obsahu sirovodiku a tak soudit na zakonitosti mezi akti-
vitou desulfurikacnich bakterii a koncentraci sirovodiku ve vodach.
V teto praci navrhujeme metodu kvantitativniho stanoveni desulfurikacnich
bakterii ve vodach, jejiz princip spociva ve srovnani krivek produkce sirovodiku ve
studovanych vodach se standardnimi krivkami, ziskanymi z cistych kultur desulfu-
rikacnich bakterii o znamem poctu zarodku v 1 ml. 7'eoreticky jsme predpokladali,
ze ziskane krivky budou stejneho charakteru a ze srovnani se standardy umozni
primo urcit mnozstvi zarodku teto skupiny bakterii.
lllaterial a metody
Kvalitativni testocani vod na pi?itomnost desulfurikacnich bakterii je popsano v praci Dostalek
a Spurny (1956), kde je rovncz uvedena prislusna literatura. Kvantitativni irdaje o cetnosti zarodku ve
vodach lze ziskat metodou deskove analysy, co~C je testa pracna a je spojena s obti'cemi pri anaerobni
kultivaci bakterii teto skupiny na deskach (Grossman a Postgate 1953). Nelze ani prakticky pou~it
metody na stanoveni poctu zarodku z hodnot mci?eni zakalu bakterijnich kultur nefelometricky, nebot
nr~i zakal prizvodni mikroflory.
Metody kultivace. Metodika kultivace, slozeni zivne pirdy, rustove charakteristiky, optima pH a rH
kultur bakterii rodu Desulfovibrio jsou podrobnc popsany v praci Dostalka a Spurneho (1956). V pokusech
jsme u~cili ~ivneho roztoku s laktatern amonnym bez Mohrovy soli a 100 ml lekovek se zabroubenym
hrdlem ke kultivaci v anaerobnich podminkach. Kultivacni teplota byla udrzovana konstatni 32 ?C.
stanoveni standardnich kr"ivek. Pro stanoveni standardnich ki?ivek produkce sirovodiku byl pokus
uspoi?adan tak, ze zakladni kultury bakterii rodu Desulfovibrio byla ockovana ve zi?edovaei i?adc 1:10,
1:1.000, 1:10.000, 1:100.000, 1:1,000.000 vzdy ve ti?ech paralelnich seriich. Zakladni kulturu pro
zi?edovaci iadu jsme ziskali z nahromadovaci kultury bakterii rodu Desulfovibrio ze sirovodikoveho
pramene Dudikovych lazni ve Vizovicich. Protoze bylo obti~ine ziskat tyto bakterie v cistych kulturach,
spokojili jsme se s piedstcnou kulturou. K pokusu jsme pou'cili ti?i dny stare kultury v logaritmicke fazi
rirstu (Dostalek a Spurny 1956), contrifugovane 15 min. pri 18.000 obr~min; balcterijni suspensi jsme
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
doplnili do puvodniho objemu'~ivnf~m roztokem a z ni piipravili ziedovaci iadu. Ze z~kladni bakterijni
suspense byl souitasng piipraven roztgrovy prepar~t a mikroskopicky stanoven poL~et z~rodku v 1 ml
kultury; tak byl zn~m poet z~rodku z~kladni bakterijni kultury a vypoL~tem byly zji~tgny potty v kul-
tur~ch z~edovaci lady. Rust kultur jsme sledovali v z~vislosti na produkci airovodiku; jak uk~zaly
vysledky pokusu, uveden~ ve shore citovang pr~,ci, je produkce airovodiku kulturami deaulfurikaL~nich
bakterii dobrym kriteriem mno~eni bakterii. Produkce airovodiku v kultur~,ch byla sledov~na teL~kovaci
reakcf na papii?e, sycengm octanem olovnatym; metodika stanovenf je popss#na v pr~ci i~lehla, Spurny
a Dosthlek (1956). Postupovali jsme tak, ~e jsme bghem kultivace odebirali z kultur sterilnf mikropipetou
vzorky o objemu 0,02 ml a nakap~vali je na octanovy papir. Skvrny jsme hodnotili srovn~nim se stan-
dardni lik~lou, z{skanou nakap~nim roztoku sirniku sodn~ho s odatupuovanou koncentracf, ovgie-
nou jodometrickou titraci. Zjibtgnych hodnot jsme pou~iili k seatrojeni kiivek produkce airovodiku
kulturami desulfurikaitnich bakterii ze ziedovaciho pokusu.
Vysledky
Vysledky ukazaly (tab. 1), ze krivky produkce airovodiku predstavuji typ k~ivek
mnozeni bakterii ve stacionarnich kulturach; jaou charakterisovany fazi zdrzeni
Tab. 1. Produkee airovodiku kulturami desulfurika~nich bakteru v z~vislosti na po~tu odkovanf~ch
z~rodku. Z~kladni kultura obsahovala 1,26. 109 zz#rodku. Hodnoty v tabulce ud~,vajf mg HZS/1.
~
~tedgni z~kladni
kultury desulfuri
kaisnich bakterii
Kultivace
v hod. ~ 1:10
I : 1 000
-
1:10 000
1:100 000
I
-
1 : 1 000 000
16,5
45
I -
-
-
~ -
24,0 i
65
-
-
I - -
t
29,5
100
15
-
~ - -
40,5
170
80
15
-
-
49,0
> 170
135
80
20
5
64,5
> 170
150
120
70
72,0
> 170
150
120
92,5
> 170
170
100,0
-- --
-
~
~
> 170
(lag fazi), logaritmickou (rustovou) a stacionarni fazi. V na~em pripad~, protoze
horni mez rozliseni akvrn je dens intenaitou, odpovidajici koncentraci 170 mg
H2Sf1, byl mnohdy zachycen jen za~atek stacionarni faze. l~,ed~ni zakladni bakterijrli
I ~i~IJ
Obr. 1. Z~vislost dglky kultivace, poti?ebne pro standardni produkci airovodiku (100 mg/1), na po~tu
desulfurika5nich bakterii v kultuie. Oea x: log po~tu D, osa y: kultivai;nf doby v hod., odpovidajici
produkci 100 mg HZS/1, extrapolovang z hodnot tabulky 1.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
suspense o koncentraci 108 zarodku desulfurikacnich bakterii v 1 ml se projevilo
prodlouzenim faze zdrzeni, kdezto rychlost mnozeni bakterii v logaritmicke fazi,
vyjadrena smernici krivky v teto fazi rustu kultur, se lisila jen malo. Hodnota smer-
nice je dana produkci sirovodiku za casovou jednotku; prakticky jsme vzali pro
vypocet usek logaritmicke faze pro produkci sirovodiku od 65 do 135 mg; 1, naneseny
na ose y, a delku logaritmicke faze v hodinach kultivace pro tuto produkci, nane-
senou na ose x. Prislusne hodnoty na obou osach byly cteny z grafu, sestrojeneho
v meritku 1 hod. = 1,5 mg HZS~1.
Tab. 2. Produkce sirovodiku kulturami desulfurikacnich bakterii, infikovanymi v pomisru D : I = 10:1.
Hodnoty v tabulce ud~vaji produkci sirovodiku v mg/1
Kultivace
v hod
1,14.10aD
I,14
.108D ~
1,14.1O5D
1,14.104D
1,14.103D
.
1,2 .10?I
1.2
.105I ~
1,2 .104I
1,2 .103I
- _ _ _
1,2 .1021
- ____
16,5
- - -
4:i
- i-
-
-
- ~i
j
- ! -
24,0
65
- ~I
-
- -
29,5
~
100 ~~
1 b
-
- -
40,.5 ' 170 ~'I
80
l:i
~
-- --
I 170 I
49,0
13:i
80
I
:i
20
64,5 >
17U
150
~
11:~ i0
72,0 ~
~
~
> 170
~ 15U ] 15
92,5 ~
~
~ 170 '~ 170
i
100,0
~ I
I
li
~ 170
I
Tab. 3. Produkce sirovodiku kulturami desulfurikacnich bakterii, infikovanymi v pomcru D : I = R : 1.
Hodnoty v tabulce udavaji produkci sirovodiku v mg~l
Kultivace
v hod.
-
8,6
. 10~ D
8.6 . 108 D
8,6
. 105 D I
I
8,6 . 104 D ~
8,6.10' D
1,2
.10? I
l,2 . 108I
1,2
. 105 I
1,2.1041
1.2.1031
~3 0 _-i
10
III
-
-
-
31,5 I
65
:i ~~
-
-
-
47,0 ~
170
6ti ~
10
-
-
55,0 I
170
130 '~
i
30 ~
l0
-
72,0
~ ~ 170 i
180
65 '
20
119,0 ~
~
~ >
170 ,i
I
> 170 ~
170
Vysledky tohoto pokusu naznacovaly, ze krivky produkce sirovodiku v ruzne
redenych kulturach budou ve sve logaritmicke fazi prakticky shodne a ze pocet
zarodku desulfurikacnich bakterii bude nepiimo umerny delce faze zdrzeni. Za tohoto
predpokladu by stacilo stanovit graficky zavislost delky lag faze na poctu desulfuri-
kacnich bakterii v kulturach extrapolaci pro standardni produkci sirovodiku.
Vyhodnocovaci graf, sestrojeny pro produkci 100 mg H2S~1, je uveden na obr. 1.
Tak jednoducha zavislost by platila za predpokladu, ze smernice krivek produkce
sirovodiku v kulturach desulfurikacnich bakterii by byly v jejich logaritmicke
fazi shodne.
Pri opakovani zredovaciho pokusu jsme zjistili, ze hodnoty smernic krivek
v logaritmicke fazi se meni v zavislosti na redeni kultur; hodnoty smernic v kulturach
s nejvyssim poctem zarodku se blizily hodnotam smernic, ziskanych v predchazejicim
pokuse, ale s postupnymredenim kultur hodnoty smernic klesaly. Bylo tedy zrejme,
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Tab. 4. Produkce sirovodiku kulturaxrxi desulfurikai'nich bakterii, infikovanymi v pom5ru D : I = 4,7 : 1.
Hodnoty v tabulce udfivaji produkci sirovodiku v mg/1
Kultivace
v hod.
17,0
23,0 I
41,0
47,0
65,0
71,0
89,0
94,0 ~
137,0 ~
Pocet D a I v ml ockovanych kultur, ~
stanoveny mikroskopicky
--- -
6,3 . 108 D
1,3 . 108 I
6,3 . 106 D
1,3 . 106 I
i
6,3.10? D
1,3.104 I
i
- I
10
-
-
-
-
25
10
5
45
20
10 ~
135
60
i
30
170
70
40
> 170
135
65
-
150
80 ~
-
> 170
> 170
Tab. 5. Produkce sirovodiku kulturaxni desulfurikainich bakterii infikovanymi v pom5ru D : I = 3,4:1.
Hodnoty v tabulce ud~vaji produkci sirovodiku v mg~l
Kultivace
Pooet D a I v l ml o5kovanych kultur,
stanoveny mikroakopicky
___ _ __
v hod.
7,3.10? D
7,3 . 103 D
7,3.102 D
2,1.10? I
2,1 . 103 I I
2,1.102 I
23,.i
-
-
30,5
-
-
_
46,0
30
-
-
i 1,0
50
30
20
7 6,0
00
40
25
118,0
l 15
85
70
142,0
~
.: 170
115
100
166,0
-
> 170
135
i
115
Tab. 0. Produkce sirovodiku kulturami desulfurika5nich bakterii, infikovanymi v pom~ru D : I = 2,3 : I .
Hodnoty v tabulce udavaji produkci sirovodiku v xng/1
j
Kultivace
Pocet D a I v l ml ockovanych kultur,
stanoveny mikroskopieky
I
v hod.
7,3 . 106 D
3,2 . 106 I
7,3 . 104 D
3,2 . 104 I
7,3 . 103 D
3,2.103 I
ii
_
23,x5
II
30,5 10 i
-
-
I 46,0 30 I
15
-
~ 1.0 ~ 55
40
10
76,0 ~ 0.5
45
`l5
118,0 ~ 125
I
80
50
142,0 150
115
80
166,0 170
135
115
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
ze rust desulfurikacnich bakterii byl v kulture brzden faktorem, ktery se uplatnoval
teprve v logaritmicke fazi jejich rustu. Pri vysetrovani tohoto faktoru jsme zjistili,
ze kultury, v nichz byl rust brzden, jevi silnejsi zakal prod tem, kde produkce siro-
vodiku probihala standardne. V dalsich pokusech se ukazalo, ze tento zjev lizce
souvisi s problemem cistoty kultur, pouzitych k pokusum.
Zisk~ni ~istych kultur bakterii rodu Desulfovibrio je velmi obti'cng, jak vyplyva z udaju literatury
(Kupzis 1928, Rubenbik 1947, Starka 1951). Za stale kontaminanty se pova~uji pi?edev~im bli~ie neur-
eene kokovite bakterie (Rubencik 1947) a kratke aporulujiei tycky gramnegativni, ureene jako kmen
Bactillus subtilis (Starka 1951). Pii podrobnem mikroskopickem studiu roztgrovych preparatu, poi?ize-
nyoh z preei~tenyeh kultur kmene Desulfovibrio, v pokuae u~iiteho, byla zji~tgna piitomnost obou shora
zmingnych kontaminantu. Tyto organismy se vyvijely na masopeptonovem agaru i na agarovane pudg
pro pgstovani desulfurikacnich bakterii jak v aerobnich, tak anaerobnich podminkach kultivace.
Na mikroskopickych preparatech, poTizenych z ruzne infikovanych kultur desulfu-
rikacnich bakterii, jsme urcovali vedle desulfurikacnich bakterii (D) mnozstvi
kontaminantu (I) a vyhodnocovali jejich pomer v kulturach (D : I), v nichz jsme
stanovovali produkci sirovodiku v zavislosti na jejich redeni. S tohoto hlediska byly
znovu hodnoceny vysledky pokusu, uvedeneho v tabulce 1. Souborne vysledky
pokusnych serif jsou uvedeny v tabulkach 2 - 7.
Tab. 7. Produkce sirovodiku kulturami desulfurikacnich bakterii, infikovanymi v pomcru D : I = 1,2:1.
Hodnoty v tabulce udavaji produkci sirovodiku v mg/1
Pocet D a I ockovanych kultur, stanoveny mikroskopiclcy
KU1t1VaCE:
v hod.
-__--__~__
2.10? D
1,7.10? I
__ -_..__--i
2. 108 D
l,7 . 108 I
-__----___-- ______
2. 104 D ~
1,7.1041
__... _ _.__.
2.108 D
l,7 . 1081
--.. _...
2~,0
5 ~ -
- ~
_-
44,0
10 -
-
--
92,ri
40 25 '
~
15
-
116,0
80 i 40
30
25
164,0 ~
115 ~ -
70
40
188,5
' 150 135
100
0?>
212,5
~ 170 ~ 150
135
66
Z vysledku vyplyva, ze produkce sirovodiku v logaritmickg fazi rustu je zavisla
jak na absolutnim mnozstvi D a I, tak i na jejich pomeru v kultuTe, a to tak, ze
absolutni mnozstvi D urcuje delku lag faze a pomer D : I urcuje hodnotu smernice
logaritmicke faze produkcnich kTivek sirovodiku (obr. 2). Hodnoty, ziskane z techto
pokusu, byly sestaveny do nomogramu (obr. 3), z nehoz lze po dosazeni hodnot
pro I a hodnot smernic zjistit pocet desulfurikacnich bakterii v 1 ml (a tim i po-
mer D : I v kultuie) a dobu potTebnou pro produkci 100 mg HZSf 1. Pro sestaveni
tohoto nomogramu jsme zhotovili pomocny graf, kde jsme vyhodnotili zavislost
hodnot smernic na dobe kultivace pro standardni produkci sirovodiku (100 mg
H~S~I) pfi danych koncentracich bakterii v kulturach (obr. 4).
Vztahy mezi jednotlivymi velicinami vyhodnocovaciho nomogramu a samo jeho
pouziti pro stanoveni poctu D plan za techto predpokladu:
1. Rychlost mnozeni zarodku a tim i rychlost produkce sirovodiku cistymi kultu-
rami desulfurikacnich bakterii v jejich logaritmicke fazi rustove zustava pii ruzne
276
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
velikosti inokula stejna, t. j. vliv velikosti inokula se neprojevuje zm~nami rychlosti
produkce airovodiku v logaritmicke fazi vyvoje kultury.
2. D~lka faze zdr~eni (log faze) - prakticky brans d~lka kultivaL~ni doby, pot~ebne
pro produkci 100 mg HZS/1 - je nepiimo lim~rna poL~tu oL~kovanych zarodku
desulfurikaL~nich bakterii.
3. Rychlost produkce sirovodiku, vyjad~ena smernici kiivek produkce sirovodiku
v logaritmick~ fazi rustu kultur, je piimo lim~rna hodnotL pom~ru D : I v pou~itkm
inokulu preL~i~t~n~ kultury desulfurika~nich bakterii.
4. Pruvodni mikroflora I, obsazena v inokulu pie~i~t~ne kultury, inhibuje vyvoj
desnlfurika~nich bakterii a tim i produkci sirovodiku.
Obr. 2. Z~vielost d~lky kultivace, potiebnB pro standardnf produkci sirovodfku (100 mg~l) na poL~tu
desulfurika5nfch bakterif v kultur~ch ruzng infikovanych. Oea x: log po5tu D, osa y: d~lky kultivabnf
doby v hod. pro produkci 100 mg HZS/1, extrapolovan~ z hodnot tabulek 2-7. StupezY infekce kultur,
vyj~,dien~ pom5rem D : I, je u pifmky 1 roven 1,2:1; (pifmka 2) 2,3:1; (pi'Imka 3) 3,4:1; (pifmka 4)
4,7:1; (pifmka 5) S : 1; (pifmka 6) 10:1).
Prvni predpoklad nebyl piimo dokazan, neboE jsme nepracovali s ~istou kulturou;
bylo v~ak prokazano, ze se zvysujici se hodnotou pomtsru D :Ise mtsnf smisrnice
produkL~nich kiivek sirovodiku v zavislosti na po~tu zarodku D v inokulu jen ne-
patrn~.
Druhy piedpoklad potvrdily vysledky pokusu, v nichz jsme sledovali prubLh
produk~nich krivek sirovodiku kulturami desulfurika~nich bakterii o danem po~tu D
ve ziedovacich pokusech; z obr. 2 je vid~t, jak s klesajicim po~tem D v kulturach ee
prodluzuje doba kultivace, potrebna pro produkci 100 mg HzS/1.
Treti piedpoklad potvrdily vysledky pokusu, v nichz jsme mikroskopicky sledo-
vali stupeli zne~i~t~ni kultur desulfurika~nich bakterii, v pokusech uiitych; prubLh
produkL~nich krivek sirovodiku, ziskanych z kultur s pomerem D : I = 1 : 1 az 10 : 1
prokazaly zavislost hodnot smernic na danem pom~ru D : I, t. j. hodnoty sm~rnic
klesaly se zmerl~ujici se hodnotou pom~ru D : I.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
K ctvrtemu predpokladu mozno uvest toto: mechanismus biochemickeho procesu
rustu desulfurikacnich bakterii v kulturach, obsahujicich pruvodni mikroorganismy,
neni v literature podrobne popsan. V nasich pokusech se ukazalo, ze inhibice vyvoje
desulfurikacnich bakterii je primo zavisla na poctu kontaminantni infekce. Tento
nalez je v rozporu s lidajem Starkovym (1951), ktery zjistil, ze pridavky extraktu
z kontaminantni mikroflory (z kultury kmene Bacillus subtilis) melt' do urcite
koncentrace stimulacni ucinek na produkci sirovodiku kulturami desulfurikacnich
bakterii; je zrejme, ze otazka vzajemneho vztahu techto organismu bude vyzadovat
dal~i studium.
i
~
i
i
i
i2 ~
i3
i
9
'D
'
,~~'
~~'
-
_
e-
L
7 1
Obr. 3. Nomogram k vyhodnoceni poctu desulfurikacnich bakterii. Osa. x: (kolm~, sit useckk) znaci log
poctu desulfurikacnich bakterii (D), osa ~: (vodorovna sit iisecek) znaci hodnoty smL~rnic ki~ivek produkce
sirovodiku v logaritmicke fazi rustu kultur. Soustava ki?ivek znaci log poctu I; hodnoty iadu uvedeny
v pruseciku kolmic pro log i~du D a piimky pro pomer D : I = 10:1. Plug vyta~Cene useky kiivek jsou
sestrojeny z experimeht~lnich dat, carkovang znaci piedpokl~dany prub~h. Plug vyta~iene usecky jsou
spojnice bode stejneho pom~ru D : I v kultur~ch. Piislusne hodnoty pomgru jsou vyznaceny u ka~de
usecky. ~ikm~, sit kiivek znaci spojnice hodnot delek kultivace, prisluenych pro standardni produkci
sirovodiku (100 mg H2S~1).
Piiklad cteni z nomogramu: je d~na hodnota smernice, vypoctena z produkcni kiivky sirovodiku,
na pi. 2,0 a poet log I (podle deskove analysy) na pr. 1 . 103.
Postup: stanovime pruse~ik piimky pro sm~rnici 2,0 s kiivkou pro log I 1 . 103; z bodu prixseciku
spuatime kolmici na abacissu a odecteme hodnotu poctu log D, v nasem piipad~ 6,2.103. Souitasn~
stanovime prusecik piimky smernice s ki?ivkami hodinov~ sits; v nasom piipad~ vyitteme, ze produkce
100 mg H2S/1 bylo dosazeno za 80 hodin.
Vyhodnocovaci nomogram byl sestaven z pokusnych kultur, kde se pomer D : I
pohyboval v rozmezi 1 : 1 az 10 : 1; v nomogramu jsou v teto zone vytazeny pri-
slusne krivky plnymi carami, mimo tuto zomu byl prubeh krivek extrapolovan
(carkovane kTivky). Pri tom jsme vychazeli z techto uvah: pro pomer D : I, nizsi
nez je hodnota 1, lze predpokladat, ze smernice budou hodnoty velmi nizke a ze
pri relativne vysokych hodnotach I pri nizkych hodnotach smernic budou hodnoty D
velmi nizke. Naopak pro pomery D : I, vyssi nez je hodnota 10, lze predpokladat, ze
smernice se budou blizit maximalnim hodnotam, jejichz teoreticka mez bude v danem
grafickem systemu mezi hodnotami 3,5 az 4,0. Zde zustava problemem stanovit
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
hodnotu sm~rnice v kulturach, kde poet D je vy~~i nez 108 zarodku v 1 ml; lze
piedpokladat, ze od urL~it~ hodnoty D v kulturach se nebude jiz smisrnice zvy~ovat,
takze pro extrfsmn~ vysok~ poL~ty D (nad 108 v ml) nelze nomogramu unit.
Obr. 4. Z~vislost hodnot smgmic produk~nfch
kizvek sirovodfku v logaritmickg fSzi rustu
kultur desulfurika~nfch bakterif na dglce kul-
tivace, potiebng pro standardnf produkci
airovodfku (100 mg~l). Osa x: doba kultivace
v hod. pro standardni produkci sirovodfku
(100 mg~l), osa y: hodnoty smgmic pro-
dukinfch kinvek sirovodfku. Jednotlive kiiv-
ky zfskk~ny z kultur o ruzngm D (i?&d D
uveden u ka~dg kiivky).
950
Jak je ziejmg z piedch~,zejfcfch odstavcu, vypracovan~ metoda je pou~iteln~ jen za urisitych p~ed-
pokladu (body 1-4); pou'~ijeme-li teto metody k analyse mikroflory piirozenych vod, dopou#tfine se
urisitych nepiesnostf tfm,Ce nebereme v uvahu v{;echny rozdilnosti mikrobiologickych podmfnek
v tgchto prost~edich. V prvg iad~ zanedb~v~me chybu, pramenfef z morinosti vyakytu desulfurika5nich
bakterif o ruzng aktivitg a ruzne schopnosti produkovat sirovodtk. Kvalitativnf rozdilnost desulfuri-
ka~nich bakterii by se mohla pi?i analyse projevit rozdilnou dglkou lag faze, pi?fpadng zmgnami v prubghu
logaritmickg ft#ze pi?i stejngm vychozfm po~tu z~rodku. I kdy~ tuto mo~nost nemu~eme vylouisit, nelze
ji tak6 na zdkladg piedbg'~nych vysledku pova~ovat za podstatny ru"sivy faktor; pii orienta5nfch
pokusech byly zji~tkny u 89 kultur desulfurikaiSnfch bakterii, isolovanych z vod airovodfkov$~ch pramenu
a z lo'Eiskovych vod, nepatme vykyvy v d81ce lag faze a intenaity produkce eirovodfku (Dost~lek a Spumy
1956).
Predpoklady, z nich'I jsme vychhzeli pii vypracov~ni metody, nepoatihujf takg dokonale kvalitativnf
rozdfly v pruvodnf mikrofloiy. Mikroorganismy, majfef vztah k desulfurikaitnim bakterifm, se mohou
projevovat v piirozenych podmfnk~ch jednak vlivem inhibi~nfm i stimulaisnfm. Pusobenf synergickych
bakterif by se mohlo uplatnit zejmgna produkef rustovych lAtek, vytv~ienfm redukL~ngjbfch podmfnek
nebo zlep~enfm pifstupu ~iivin. Vlivy tohoto druhu byly vylouiseny vhodnou upravou ~ivn~ pudy pi?i-
d~nfm kvasniisneho extraktu a sii7~itanu sodn~ho i pou~itfm mlgisnanu, ktery je dobie asimilov~n
desulfurikaCnfmi bakteriemi. Na druh6 atrang vliv antagonickg mikroflory mine byt mnohostranny
a nelze jej v~idy vylouiSit upravou kultiva~nfch podmfnek; jde piedev~im o mo'~nost produkce kyselin,
antibiotik, oxydaci sirovodfku, intensivngj~f spoti?ebu ~ivin a j. Tyto inhibiinf vlivy mohou byt ov&em
rozdfing podle druhu pruvodne mikroflory. Hodnota I nenf proto pii obecn~m pou~iti navrhovang
metody br~na jako absolutnf hodnota po~tu z~rodku urbite bakterijnf skupiny, ale jako mica intensity
inhibiL~nfho pusobeni pruvodnfch bakterii. V tomto pojetf nemuaf mft metodickg zjednodu~eni mikro-
bijnfch pomgru ve vod~ch nepiiznivy vliv na obecne pou'~itf navrhovane metody.
Jak jiz bylo uvedeno v uvodu, byla metoda vypracovana pro hydromikrobiolo-
gicky pruzkum naftonad~jnych oblasti. Pouziti klasickych metod stanoveni po~tu
bakterii (deskove nebo zredovaci) nenf vhodne pro tyto likely. Pii tLchto metodach
se pracuje isolovane s kulturami studovanych skupin a nenf mozno zpravidla pii-
hlizet k mikroorganismum pruvodnim, ktere v piirozenych podminkach ovliviiujf
aktivitu piislusne fysiologicke skupiny. Tento nedostatek jsme se snazili odstranit
pTi vypracovane analyticke metody tim, ze kultivaL~ni podminky i zpusob sledovani
aktivity bakterii byly upraveny tak, aby umoznovaly zachyceni vlivu pruvodni
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
mikroflory. Byli jsme si vedomi toho, ze sledovani metabolismu smesnych kultur
je otazka slozita, o eemz svedei skuteenost, ze s metodami pro prate tohoto druhu se
prakticky v literature nesetkavame.
Slozeni mikrobijnich asociaci ve studovanem materialu, v hlubinnych vodach, je
velmi ruznorode, takze nebylo mozno vyhnout se jiste schematisaci; jestlize v~ak
metoda, jak jsme prokazali, dava moznost hodnoceni vlivu pruvodni mikroflory,
brzdici produkci sirovodiku desulfurikacnimi bakteriemi, je ji mozno s hlediska
vytL~eneho cile povazovat za vyhovujici. Poskytuje totiz moznost ureeni poetu de-
sulfurikacnich bakterii a soucasne i zjisteni, do jake miry maze byt jejich aktivita
brzdena v prirozenych podminkach jinymi biologickymi einiteli.
1. Vypracovali jsme kvantitativni metoda stanoveni poetu desulfurikaenich
bakterii, jejiz princip spoeiva ve srovnani krivek produkce sirovodiku v kulturach,
piipravenych z vod sirovodikovych pramenu, se standardnimi produkenimi kTiv-
kami, ziskanymi z kultur desulfurikacnich bakterii o znamem poetu zarodku v 1 ml.
2. Pouziti Leto metody pro potreby hydrologickeho pruzkumu naftonadujnych
oblasti vyzadovalo pracovat se smesnymi kulturami.
3. Zhotovili jsme vyhodnocovaci nomogram, ktery dovoluje stanovit poeet
desulfurikac~nich bakterii v kulturach v radovem rozpeti 101 az 108 zarodku v 1 ml.
Dostalek, M., Spurny, M.: Kultivalni charakteristiky desulfurikal!nich bakterii z naftovych lo~iaek. ~s.
mikrobiol. 1 : 158, 1956.
Ekzercev, V. A., Kuzn~cov, S. L: Issledovanija mikroflory neftenosnych mestorofdenij Vtorovo Baku.
Mikrobiologija 23:3, 1954.
Gahl, R., Anderson, B.: Sulphate reducing bacteria in California oil waters. Zbl. Bakter. II,
73:331, 1928.
Gartner, O.: O geologickem puvodu naoravsko-slezskych mineralnich pramena~. ~asopis VlastivL~d. spolku
musej. v Olomouci 12:1, 1929.
Ginzburg-Karagiceva, T. L.: Microflora of oil waters and oil bearing formations and biochemical processes
caused by tit. Bull. Am. Assoc. Petroleum Geol. 17:52, 1933.
Grossman, J. P., Postgate, J. R.: Cultivation of sulfate reducing bacteria. Nature 171:600, 1953.
Isabenko, V.: On the microorganisms of the lower limits of the biosphere. J. Batt., 40:379, 1940.
Kupzia, J.: Die biochemischen Vorgange im Schweffel-and Moorbade Kemmern in Lettland. Zbl. Bakter. 76,
1928.
Mahel, M.: Mineralise pramene Slovenska so zretelom na geologickzi stavbu. Prate tat. geol. ustavu,
Bratislava (27), 1952.
Rubenbik, L. L: Sulfatreducirujuac~ije bakteriji. Moskva 1947.
Spurny, M., Dostalek, M.: Mikrobiologie hlubinnych vod naftonaddjnych oblasti. Prate YJstavu pro naftovy
vyzkum, Brno 1956. V tisku.
Starks, J.: Nove poznatky o mikrobialni redukci sulfate. Biologicke linty 32:108, 1951..
Sturm, L. D.: Materialy po mikrobiologic~eskomu issledovaniju neftjanych mestorozdenij Vtorovo Baku.
Trudy Inst. nefti 1:97, 1950.
ITlehla, J., Spurny, M., Dostalek, M.: Pou~iti teL~kovaci reakce na airovodik phi sledovani siranov~ redukce.
~s. mikrobiol. 1 : 267, 1956.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
M@TOJ~ KOJII3LIeCTBOHHOI'O TIOJjCLIeTB CyJib(~BTBO~CT8H8BJII3B8IOIIiI3X 6aKTePI31i
M. Cnypxa~u, M. ,l~ocmaneis u 70, Y.~eena
PealoMe
SbIJI Bblpa6oTaH McTOJ{ KonH~ecTaexxoro onpeAenexxx cynbc~aTBOCCTaxaBnHBaloluxx 6axTepHil,
OCHOBBHHbIfI Ha CpaBH2HHn KpHBbIX BbIJ~eJIeHHH ceposoAopoAa B KyJIbTypaX N3 BOJ{ CepOBOJ{O-
pOj(HbIX NCTOYHHKOB H CTaHJ{apTHbIX KpHBbIX npoJ~yKI;Hn, nOSyYaeMbIX Ha CMeHI3HHbIX Hy7lbTyp
Cynbc~aTBOCCTBHaBJIHBaI01I(HX 6axTepH~I npH HaBOCTHOM HOJII3`iCCTBe 6aKTepHi1 B 1 MJI. Bbina
COCTaBJIeHa I3HTepnpeTlljHOHHaH HOMOrpaMMa, H03BOJIHIOH1aH OnpCJ~eJIHTb HOJIH9eCTB0 CyJIb(~IaT-
B000TflHBBJIHBaIOH1xX 6aKTepH11 KyJIbTypbl B npeAesax nopHAKOB oT 101 Ro 108 6axTepH#/1 MJI. -
PCayJIbTaTaM Li HpeAesaM HpaHTH'IeCHOPO npHM0H0HHH npeAnaraeMOrO MOTOAa HpOCJIeH{NB8HAH
aKTNBHOCTH CyJIb(~11TB000TflHaBJIHBaIOIIlI3X 6aKTepHfl B rJIy6HHHbIX BOJ{aX HepCHeHTNBHbIX B OTHO-
IIIeHHH He(~ITOHOCHOCTH pa~rIOHOB 6yAeT nOCBHH[eHa OTJ~eJIbHafl CTBTbH.
A Method for Evaluating the Sulphate Reducing Bacteria
M. Spurny, M. Doatklek and J. iSlehla
Summary
A quantitative method for estimating the number of sulphate reducing bacteria was developed, the
principle of which is based upon a comparison between the hydrogen sulphide production curves from
waters under examination and standard production curves, obtained from mixed cultures of sulphate
reducing bacteria of a known number of organisms per ml. A nomogram for evaluating the number of
sulphate reducing bacteria in cultures in limits of 101-108 organisms per ml, waa constructed.
The results and limits of practical application of the method proposed for studying the activity of
sulphate reducing bacteria of underground waters in oil bearing areas will be discussed in a next paper.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
L~eskoslovenskca
M I K R O B I O L O G I E
rocnik Y. (1956) - ~. 6
K otazke virusovych receptorov
O elektivnej aglutinabilite syslich erytrocytov
LADISLAV BORECKY
Objavenie fenomenu virusovej hemaglutinacie Hirstom (1941) umoznilo vypra-
covanie rozlicnych metod titracie viacerych virusov, resp. virusovych protilatok.
O vyzname objavu svedci i to; ze nasiel uplatnenie i pri jemnejsej analyze vlastnosti
virusov, napr. pri zostaveni receptoroveho gradients (Burnet, McCrea a Stone 1946),
pri ur~ovani spektra aglutinovanych druhov erytrocytov ur~itym virusom (Horvath
a spol. 1950), pri zisEovani charakteru adsorpcnej a elucnej krivky urciteho virusu
(Kozinski a spol. 1953) std.
Ukazalo sa, ze ide o zjav vo svete virusov a mikroorganizmov vobec veTmi rozsireny, presahujuci
ramec virusov zo skupiny mumps-newcastelska choroba-chripka. Schopnost hemaglutinovat za vhodnych
pomienok sa zistuje u stale vacsieho poctu virusov (Rivers 1952, Gajdamovic-~ubladze 1954, Sw?et 1954).
O povahe tohto fenomenu sa nemo~no ani dnes, t. j. po 15 rokoch, definitivne vyslovit, je vsak mnoho
dovodov pre to, aby sme ho pova~ovali za fermentativny dej, pri ktorom - aspon v pripade virusov
zo skupiny mumps-newcastelska choroba-chripka (v dalsom MNCh) - dochadza k rozkladu receptorovej
substancie, uloienej na povrchu alebo v stene bunky (Hirst 1942, Burnet, McCrea a Stone 1946, Hanig
1948, Ada a Stono 1950, Gottschalk 1953, Kradolfer 1954). Je pravdepodobne, ze pozorovana aglutinacia
erytrocytov virusmi zo skupiny variolovakcina-ektromelia-meningopneumGnia je podmienena inymi
faktormi (fosfolipidy - Burnet a Stone 1946, Stone 1946) a zas iny, dosiaT neznamy, mechanizmus sa
uplatnuje pri hemaglutinacii sposobenej neurovirusmi a virusom slintacky a krivacky. Podia Hirsta
(cit. Rivers 1952) priebeh adsorpcie v tomto pripade pripomina dvojfazovu adsorpciu fags na vnimavu
bunku (Garen a Puck 1951).
Fenomen hemaglutinacie je castym predmetom badania i preto, 'fie je modelom interakcie virusu
s bunkou. I ked sa da proti tejto koncepcii namietnut, ze v krvinkach sa virus (podia nasich dne3nych
znalosti) nemnozi, je predsa vise argumentov, ktore odovodnuju taketostudie. Nemoze byti totiz
pochybnosti o tom, ~e 1. prva faza interakcie virusu s bunkou - vysledkom krotej moze byt, podia
povahy bunky, tak infekcia, ako aglutinacia - je podmienena tymi istymi faktormi (Gottschalk 1953);
2. mechanizmy braniace aglutinacii brania i infekcii (enzym rozkladajuci receptory Stone 1948, Fazekas
de St. Groth 1948, Gottschalk 1953, polysacharidy Horsfall a Ginsberg 1949; chlorofylin Barnard 1954);
3. niektore virusy su schopne aglutinovati nielen krvinky, ale i ine ~Civocisne bunky (nspr. spermie, fibrob-
lasty, Chu 1953).
To, co sme povedali, odovodnuje i nasu studiu, v ktorej poukazujeme na existenciu
specifikovanej receptorovej substancie na povrchu syslich erytrocytov, vstupu-
jlicich do elektivnej reakcie s niektorymi predstaviteTmi skupiny MNCh.
Material a metody
Krvinky. Erytroeyty sysTa (CitelLus citellus) sme ziskali srdeovou punkeiou. Zvierata znasali opako-
vany odber 0,7 az 1,0 ml krvi bez Eaikoati. Syslie erytrocyty maju priemer 5-6 ?, su bezjaderne, okruhlo.
Na rozdiel od erytrocytov inych laboratornych zvierat boli vysetrovane vzorky syslich erytrocytov
Rh-pozitivne a mali skupinovy AB antigen. Erytroeyty sme trikrat preprali vo fyziologickom roztoku
a udrzovali pri -~- 4 ?C v 20% suspenzii.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Slepacie erytrocyty sme ziskali tieE ardcovou punkciou. Spracovali sme ich obdobne ako syalie.
V pokusoch sme skubali oba druhy krviniek obyL~ajne paralelne.
Virus. V prQci sme pou'~ili tieto druhy a typy virusov: 1. Virus chripky typ A: kmene PR 8, Weiss;
typ A': FM1, Rhodea a Sweden, H2 52, t~s 4/54, ~s 5/54, ~s 8/54; typ B: Lee, tws/49, ~a 1/1952,
Lea 4/1952, ~s 3/1952; typ C: C-1233 (Taylor), RM 13/53-Hung, ~s 1/1952, ~s 3/52. 2. Virus chripky
prasiec: Infl. Buis-55 (Sw-55). 3. Virus mumpau: kmeii Hanle (Mu). 4.. Vfrua newcastelskej choroby:
kme>`i Bratislava (NDV). 5. Virus vakcinie: kmeu ?Biogena" (Vakc.).
Enzym rozkladajzici reeeptory (RDE): Pripravili sme ho z kmer5a V. eholerae 4Z pasQ'~ou cez alantoicky
vak 12di'iov$~ch kuracfch embryi. Alantoick~ tekutina vybranh z vajec 24 hodin po infekcii kmeuom 4Z -
po scentrifugovanf - tvorila surovy proparht RDE. Jeho titer ame stanovili podia Burneta a Stonea
(1946). Titer bol obybajne 1 : b12-1024.
Hemaglutina6ri~ titre sme robili akumavkovou metSdou (Bla>;kovib a sp. 1953). Krvinky ame obyL~ajne
pou~ili v 0,5% koncentr~cu. Fyziologick~ roztok sme robili z redestilovanej vody s 0,85 % NaCI.
Rozlotenie reeeptorov krviniek p6sobeni,m virusov sa robilo podia Whitsa (1953). K alantoickej tekutine
obsahujucej virus sa pridali akumang erytrocyty v takom mno~stve, aby tvorili v nej 10% auepenziu.
Zmes sa udr'~ovala 4 hod. pri 37 ?C. Potom sa erytrocyty trikr~t preprali fyziologick~n roztokom a po
zriedenf na O,b % (vo fyziolog. roztoku) sa teatovali na stabilitu (spent. aglutinhciu). K nestabilnym
erytrocytom (obybajne po posobeni viruau LEE) sa pridalo v rovnakom pomere prfslu#ng imunne sgrum
riedenb 1 : 50 a zmea sa udr~ovala cez noc pri -~- 4 ?C. Kontrolu tvorili krvinky auspendovane vo fyziolog.
roztoku za rovnakych podmienok inkub~cie. Stupeii rozlo~enia sa zistioval v hemaglutinaL~nom taste
pomocou 6 btandardnych kmenov virusov zo skupiny MNCh.
Rozlo~enie reeeptorov krviniek p8sobenim RDE. Oavedbila sa nhm i to mierne upravenh metoda
Whitea (1953). Prepar~t RDE sme riedili vo fyziolog. roztoku tak, aby na 1 ml pripadlo 1000 a'~ 31 jedno-
tiek RDE. K tymto riedeniam RDE ame pridali erytrocyty v takom mno'~stve, aby tvorili 10% auspenziu.
Zmesi sme ulo'cili na 4 hod. pri 37 ?C, potom ame k nun pridali 5% citrht sodny do 2 obj. %. ~L~elom
pridania citrhtu sodngho je zastaviE p8sobenie RDE. Naaledovala centrifughcia suapenzii a dvojnfisobnu
premytie fyziologickym roztokom. Kontrolu tvorili erytrocyty suspendovang vo fyziologickom roztoku
a inkubovang za rovnakych podmienok ako erytrocyty suspendovang v riedeniach RDE. Stupeu roz-
lo~enia vfrusovfich receptorov sme zistovali v hemaglutinabnom testa i3iestimi btandardn~rni viruami
zo skupiny MNCh.
Priebeh adsorpcie u elude virusov na erytrocytoch. Sledovali ame ju pomocou metodiky Koziciskeho,
Mikulaszeka a Siteka (1953). Do lady aktimaviek sme dali po 0,2 ml 20 % erytrocytov a po 1 ml virusovej
tekutiny. Po ddkladnom promietianf sme skumavky uloisili pri 0 ?C na 1-2 hod. V urcitych intervaloch
sme jednotliv~ skumavky vybrali, scentrifugovali a vtekutine nad usadkom sme zistovali hemagluti-
naL~nym testom mno~atvo neadaorbovaneho vfrusu.
Pri elucii sme postupovali vo v~bliine prfpadov tak, 'ce po predchhdzajucej adsorpcii pri 0 ?C sme
suspenzie scentrifugovali a tekutinu nad usadkom (povodnu vfrusovu tekutinu) sme nahradili rovnakym
objemom fyziologickeho roztoku o pH 7,2. Suspenzie sme preniesli do termoatatu (37 ?C) a v urbitych
intervaloch, obybajne polhodinovych, ame v scentrifugovanych vzork~ch zistovali hemaglutinabnym
testom mno'Estvo eluovaneho vfrusu. V inych prfpadoch sme po adsorpcii povodnu virusovu tekutinu
nevymenili, ale sme ziatiovali postupne pribtidanie vfrusu v tekutine nad usadkom v priebehe inkubhcie
suapenzif pri 37 ?C.
Vysledky
Listili sme, ze syalie erytrocyty sa aglutinuju viruami chripky typu B a C a atypicky
virusom newcastelskej choroby (NDV). AtypiL~nosE sa prejavovala v stale] pritom-
nosti prozony. Nikdy ame nepozorovali aglutinaciu syslich erytrocytov viruami
chripky typu A a A', virusom chripky prasiec, virusom mumpsu a virusom vakcinie.
Kym hemaglutina~ne titre (s 0,5% erytrocytmi) sklisanych B kmenov virusu
chripky boli asi rovnako vysoke ako pri pouziti slepacich erytrocytov, virusy typu C
aglutinovali syalie erytrocyty asi do 4-8krat nizsieho titru ako slepa~ie. Agluti-
nacia syslich erytrocytov bola pri 0 ?C, -{- 4 ?C a pri izbovej teplote asi rovnakeho
stupna, pri teplote 37 ?C sa nepozorovala.
Elektivnu aglutinabilitu sme v pripade 5 B kmenov potvrdili virusovymi tekuti-
nami desiatich rozliL~nych vaje~nych pasazi (kmen Lee bol zo 154. pasaze, ostatne
kmene z 11, az 48. pasaze), v pripade 4 C kmenov na materiali z 5 pasazi (8. az 17.).
Opakovane skti~ky aglutinability syslich erytrocytov s inymi predstaviteTmi virusov
zo skupiny MNCh boli za r6znych podmienok teploty a trvania inkubacie opatovne
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
negatfvne. Z tohoto nacho poznatku vyplyva moznosE praktick~ho pouzitia syslich
erytrocytov ako pomocky pre ur~enie typu neznameho virusu (tabuTka 1).
Vlastnosti virusovych receptorov na syslich erytrocytoch sa studovali najma
z hTadiska vzEahu k 2 virusom, ktorymi sa tieto erytrocyty aglutinuju: virusu Lee
(typ B) a virusu C (~s 1952).
dab. 1. Schematicke rozdelenie virusov podia ich schop-
nosti aglutinovati syslie erytrocyty.
-- - _ -~
Aglutinz#cia
syslich
erytrocytov
2. virus chripky typ C
3. (virus newcastelskej choroby)
1. virus chripky typ A
'l. virus chripky typ A'
3. virus chripky prasiec
4. virus mumpsu
5f2
256
128
6<
32
76
e
K 0,f
20
~tudium dynamiky adsorpcie
virusov Lee a C na syslie eryt-
rocyty ukazalo, ze virus Lee sa
adsorpuje uz po~as i/2 hodiny te-
mer kvantitativne, kym pre virus
C je stupen adsorpcie umerny
mnozstvu erytrocytov pridanych
k virusovej tekutine (obr. 1).
Na obr. 1 B je znazornena ad-
sorbcia virusu C na syslie erytro-
cyty po ich predchadzajucej expo-
zicii neriedenemu preparatu RDE.
Zistujeme, ze stupen adsorpcie
na takto spracovane erytrocyty
je va~si v porovnani s rovna-
kym mnozstvom normalnych
syslich erytrocytov. Takyto u~i-
nok RDE na slepacie erytrocyty
sme nepozorovali.
Obr. 2 znazornuje casovy prie-
beh adsorpcie a elucie virusov Lee
a C na syslich a slepacich erytro-
cytoch (mnozstvo erytrocytov
0,4 ml - 50 % na 1 ml virusovej
tekutiny). Vidime, ze krivka
adsorpcie a elucie v tomto ty-
pickom experimente prebieha na
syslich a slepacich erytrocytoch
podobne. Graf sucasne ukazuje,
ze predchadzajuca adsorpcie a
elucie virusu Lee na erytrocyty
neovplyvnuje v podstate krivku
adsorpcie a elucie virusu C na sys-
lich aslepacich erytrocytoch. Na
slepacich erytrocytoch podobny
zjav pozoroval uz Hirst (1950).
Obr. 1. A. Stupen adsorpcie Lee a C virusu
na rozlicne mnozstva syslich erytrocytov
pri 0 ?C. Pr~zdny stipec -virus C, piny
stipec - kmen Lee. B. Adsorpcia C viru-
su na syslie erytrocyty po predchli,dzaju-
eom pSsobeni RDE na krvinky. K -
kontrola, pr{~zdny stipec -virus C, piny
stipec - virus C po RDE. Osa x: mnoz-
stvo erytrocytov v ml, 20% a 40% konc.
Osa y: titer aglutin~cie.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
0,3 O5
20 20
0
20
0,9 mi
20
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Pri sledovanf schopnosti jednotlivych virusov skupiny MNCh rozkladaE vfrusov~
receptory na syslich a slepa~fch erytrocytoch sme opakovane pozorovali zaujfmavy
zjav zvy~enia aglutinability syslich erytrocytov virusom C po predchadzajucom
p8sobenf na tieto erytrocyty virusom Lee. Tento zjav bol specificky pre syslie
Obr. 2. Priebeh adsorpcie a elucie v{rusov Lee a C na syslich (A) a slepaL~{ch (vt~Lich - B) erytrocytoch.
Krivka 1 - C po Lee, 2 - C, 3 -Lee. Os x: itas v xninutach pri 0 a 37 ?C, os y: titer aglutin~,cie.
Erytrocyty
_ __
po p6soben{
v{rasa
Hemaglutinabng testy s v{rusmi
--
__ _
PR 8 I LEE I A'-54 I C-52 I
NDV
I Mu
Sw-55
LEE
256
512*
i 256
2048
-
-
512
C-b2
512
512
512
-
1024
-
I 256
NDV
128
256
256
2048
-
-
256
Sw-55
512
512
512
2048
1024
-
512
Kontrola
512
512
512
2048
2048
64
512
* Titer LEE po pSsobeni v{rasa LEE v niektorych pr{padoch klesol a~ na 25 %, v inych sa nemenil.
Erytrocyty
po posoben{
v{rasa
LEE
C-52
NDV
Sw-55
Kontrola
Tabulka 2,
Posobenie vfrusov na receptory slepaL~fch a ayel{ch erytrocytov
Slepaitie erytrocyty
~oz<
3 t2
256
~2B
C-52 I NDV I Mu I Sw-b5
-
128
- I
4096
-
-
256
-
-
512
--
256
-
256
- ~
256
-
256
256
- i
512
-
128
512
erytrocyty, pretoze v pripade slepa~ich erytrocytov zistents titre nikdy nepresahovali
ramec technickych chyb. Typicky experiment znazornuje tab. 2 (so slepaL~fmi
a syslimi erytrocytmi). Z pokusov vyplyva i to, ze posobenie rozli~nych virusov na
syslie erytrocyty neovplyv~iuje elektfvnu aglutinabilitu tychto erytrocytov (krvinky
nenadobudli achopnosE aglutinovaE sa vfrusmi chripky A, A', mumpsu a prasa-
~ej chripky).
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Podobny ti5inok ako virus Lee mali i vzorky RDE v tom zmysle, ze hemagluti-
na~ny titer syslich erytrocytov s virusom C znacne stupol po predchadzajucej
inkubacii s preparatom RDE (1000-250 j ). Receptorovy gradient na zaklade
p6sobenia RDE znazornuje obr. 3. SpravnosE pouzitej metodiky potvrdzuju vysledky
ziskane so slepa~imi erytrocytmi, ktore su v sulade s vysledkami uvedenymi v litera-
ture (Burnet, McCrea a Stone 1946, Burnet a Stone 1946, Kozinski a Slonim
1952a, b, obr. 2 A).
wsb
.r~-20Luu
PeaioMe
1~1bI yCTBHOBHJ141, 9T0 8pHT1lOI(HTbI CVC71HKa (C11e11US C1te11US) aI'rSIiOTHHHpyIOTCK B11pyC3MIi
CpHHHa THHa B H C K BHpyCOM HbIOK~CJIbCKOII 6oseaHH H He arrJIIOTHHHpyIOTCH BHpyCaMH THna
A H Ai, HapOTI1Ta, rpiiHHa CBHHeiYI H BBKIjHHHH. PTO HBJIeHHe MOHtHO HCHOJIb30BaTb KaK J~HaPHOCTH-
4eCKH~'i KpHTepHlii HpH OHpeAeJIeHNH THHa HeH3BCCTHOPO HITaMMa. B BOHpOCe pa3MeH(eHHH BHpyCHbIX
peB;eHTOpOB Ha HOBepXHOCTH KpOBHHbIX TeJIell, MbI yCTBHOBHJIH, 9T0 peLjetITOpbI J.{7IH BlipyCa C OT9aCTH
nepexpbisaloTCSi KneTOaxbiMH cTpyxTypaMH, OJ{HaKO B03J[e1fICTByH Ha aTli CTpyKTblpbl BHpyCOM Lee
HJIH RDE, HX MO}KHO yCTpaHHTb H pe1~eHTOpbI.
Concerning the Question of Virus Receptors
The Elective Agglutinability of the Erythrocytes of the Ground Squirrel
L. Borecky
Summary
It was found that the erythrocytes of the ground squirrel (Citellus citellus) are agglutinated by the
virus of influenza of the B and C types and by the virus of Newcastle disease, but not by the viruses
of influenza A and A', mumps, swine influenza or vaccinia. This may be used as a diagnostic aid in
determining the type of an unknown strain. A contribution was made to the question of the surface
distribution of virus receptors on the blood cells by the finding that the receptors for the influenza C virus
are partially covered by cellular structures which can be removed by the action of the Lee and RDF.
viruses, thus ?exposing" the receptors.
VydS,v& Biologicky ustav ~eskoslovenskg akademie vgd v Nakladatelstvi ~s. akademie vSd,
Vodibkova 40, Praha II. Adresa redakce: Biologicky iistav L~SAV, Na cvici~ti 2, Praha XIX.
Administrate: Nakladatelstvi ~s, akademie vgd, Vodibkova 40, Praha II, tel. 246241. >'Jbet
StS,tni hanky L~eakoslovenakg 5 438-214-0087, iSislo smgrovaci 0152-1. Snizeny poplatek povolen
vymgrem b. 313-400-Be-55. Dohledaci postovni uTad Praha 022. Tiaknou a expeduji: Pra'cskg
tisklirny, n. p., provozovna 04, Praha XIII, Samova 12. Vy~lo dne 17. prosince 1956. - A-22048
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
COJ~EP~ICAIII~IE
B0pa1{, I{. LI liypPCp, NL: ~I3y~ICHiLe O]ITI3MaJIbHbIX yCJIOBxIl OCaxapxBaAnR HapTO(~GJIbIibIx
3aTOpOB nJICCHCBbIMII (~)GpMCHTHbIMII npenapa'raMli 97
Lepan, I{., Byprep, M. II 3e.neHKa, C.: IToBbre Aallrrble, noJlyuexxbre npri IicnoJlbaoxaxxx
rpI161soBbrx aMxJioJtxTxuecKlix npenapaTOB ]J;dIR caxapli~iHKagHx KapTOC~reJrbxbrx aaTOpoB.
IIoJlynpoli3noAcTBexxbre onblTbl c rpx6KOBbIMIi rrpenapaTaMx npn Bbrpa6oTKe cnrip'ra xs
xap'roTjieJIR .193
Bopel~KUii, JI.: K Bonpocy I3IIpycllbrx pegenTOpoB. 06 Ii36xpa'reJrbxoil arrJlx3TxxxpyenlocTli,
apllTpognTOB cycJlnKa .282
Byprep, NI. II Bepax, K.: 0 TpancrJrlol{o3liAagrioxnoil AeRTeJlbxocTli ax3xMaTHUecxoro npena-
pa'ra nsiecexll Aspergillus niger 26
Byprep, NT., POI{OC, 1'I. x IIpoxa3Ka, II.: BJIiIRxlie xJlop'reTpagliKJllixa xa aI{THBxocTb
a -a Mri JIa sbI 10 5
BIitlTep, B.: Cnopoo6pa3oxanxe 6agnJIJI. II. Ilpo'reoJlllTxueclslie axsxmbl B npollecce cnopo-
o6pa3oBaxxR yBacillus megatherium 63
Br1IITCp, B.: CnOp00 ~pa30B:IHxR ~aI~3IJI.TI. lll. rlCpCxOJ{ KaJIbI[xR B I{JICTKx x CHHH{CHxC
npo'reoJlli'rliuecxoil aKTnnxocTll cpeAbl B Teuellxe cnopoo6pa3onaxliR yBacillus megatherium 145
Ba1~CCp, FI. LL J1bICCHKO, O.: Cen'rIIKeMIix TyTOB01'0 meJlKOnpRAa .216
~ocTaJrel{, NI. 12 Cnypxbll`I,. M.: I{yJrbTr~iBagnoxxbre xapaKTeplicTHKx AecyJrb~iypzlpyroLl~nx
6axTepliii xeljlTaxbrx Mec'ropoxsAeHIIiI 158
Z[pO~IIIIK, fl.: PdCll~eIIJICH14e aCnapal'11Ha 9H3HMaTIIUCCKHM KOMnJICi{COM n09BbI . 47
~brp , LI. Il IIpoTlixa, IO.:1TpoAyr,'rbI o6Mexa Ben~ecTB B Teuexlie poc'ra Clostridium acetobutylicum 151
3ailljrepT, ,`T.: MHKpo6xoJrorri~Iecl~ie Hpoueccbl x KaTaJrxTxuecxaR cnoco6xocTb nouBbl 74
IiloraxoscKliii, 10.: Coc'roxxxe xel3ocnplillMVl3BOCTIi B Teuexxe axcnepxnlex'raJibxol3 c'rac~3liJlo-
~~rr KOI{KOBO1$ I1x(~1C KL[IIx. I. 16
].~10 raxOBCHr14l, 10.: COOTO HxxO xe BOCnpnnMUnBO CTII 13 TC9CHIIe 3I{Cnepn Me HTaJIb1401.1 CTal~7rIJI0-
KoxKOSO~i IiH1~eKuriH. II. .111
I{aJII1III{GI'AiICK, ~,: PacnpOCTpaIICHxC aHTIlIIOMIiI[eTOB B 30HC KopHeLI IICKOTOpbIX 3JIaKOB B TCUCHIIC
BC PCTaL[MII 211
PH{Iira, ICI. Ir P>KIn'oxa, JI.: BJIIInIIIIG npxcy'rc'rBI-ia aIITIiTe.n B KyJIbTllsagxoxxoi/ cpeAe Ha pocT
Salmonella paratyphi B 59
Cax'ro, FI.: TIi'rpagriR Bxpyca rpllrina B TKaxeBbrx KyJIb'rypax . 41
CaxTO, FI. x BJJICHTUBa, I-I.: J~IIxaMYIKa pa3Mxoxsexl3 Fl BYip yca rpHnna B TKaIIeBbIx KyJIbTyp ax
I3o Bpan~alox~Ilxcn npo61lpxax .227
CBOGoAa, M. H ll[aJInJlas'ra, R.: K BOnpOCy O~iIICTKII c'rovnbrx BoA 3aBOAoB no nepepa6o'rxe
MoJloxa npll nonlou~Il Oospora lactis .176
Cnypxbrii, 1~I., Z(oc'raJlex, M. x YJierJla, IO.: Me'roA KoJllivec'rxexHOro noACUe'ra cy.nbl~iaTBOC-
c'raxaJlriBalotgllx 6aKTepllii .272
CTapI{a, IO. ri 3ranaAa, FL: OTxomexxe McTaT~occ~~aTa K o6~pa.3oBaxIllo BoJrIOTIixa y ApoH{HSeiI 70
~)'pHlca, ,~,: BJII4RIIIiC HCJ~OCTaTKa rIJIH 333~bITI{a B nliHjC ~CJIKOB Ha IiMMyHHyIO peaKl[IIIO.
I. I{paTKOBpeMexxoe AeI`icTBI-Ie AI~i3TbI 49
7~pHKa, ~,: BJrIitlHxe IICJ.I;OCTaTKa nJlx I136bITI{a B nHLIiC (7eJIKOB IIa nMMyHHyIO peaKI~PIIO.
I I. ~~JniTeJibxaH AIIaTa 123
YJrer~a, IO., GnypxblN, M. I1 JXocmaJrex, M.: IIprinlexeHlle ToueuxoH peaxq>~ri rra cepoBORopoA
npx nccJteAoxaxml 61lonorl~ivecxoro BoccTatioBJrexKR cyJrbl~aTOB .267
XaJtoynKa, IO.: IIpoTeoJrHTlluecKlie oH3riMbl aKTrixoMHueTa Streptomyces griseus. II. BJrHRxxe
xapax'repa x Koxgex'rpar~nla aaoTa xa BbIAeJlexxe nFo'reasbl 32
?iaJloynHa, IO.: 11pOTCOJIriTHiTP,CKI10 3II3IIMbl aKTIiHOMIII~eTa StrCptOmyCCS grISCHS. I lI. 1fpaTKO-
cpo-mrxona, A.: HOBbTN axTx6noTHK BU 271 223
IIIeB=xiK, B., IIoAor~iJr, M., ICIICeJrona, M. x BpTIiII,IKOSa, A.: 1jOBbI[I axTH6itoTxK BU 306 263
IT1xJrraxxoBa, Jl.:.Bblpo6ouHOe noAaBJrexue R-I~iopM Apox{xsex .204
IIITCpI[Jib, FI.: ~JIIITGJIbHaR IIMMyHI33aI[HR. I. 7'OpMO}KCIIIiC 06pa30B3xxR aHTYITCJf npx
CH{CAHCBHOI~I SIMMyHn3aljxx 7
IIITCpuJrb, 13.: AJII[TEJIbHaR xMMyHn3al~nR. lI. IQ3MCHCHnH 13 nCpHTOHCaJIHOM 3KCCy~{a'rC,
B Jte~ixolillTapxol`i x TeMnepaTypxo~i peaxglill 165
IIITepuJrb, R. BI I{pa.nKK, O.: McTOAIixa IiMMyr~i3alr,lin c n~nlKpoxxmepBaJraMH 139
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
:gym
Beran K., Burger M.: A Study of Optimal Conditions for the Sacclarification of Potato Mash
by Fungoid Enzymatic Preparations
97
Beran K., Burger M., Zelenka S.: I\Tew Findings in the Use of Amylolytic Preparations of 1 ungi for
Saccharification of Starch in,Potato Mash
. .
193
Borecky L.:'Concerning the Question of Virus Receptors. The Elective Agglutinability of the
Erythrocytes of the Ground Squirrel ..
. .
282
Burger M., Beran K.: On the Transglucoaidational Activity of an Enzymatic Preparation of tlxe
Fungus Aspergillus niger
. .
2G
Burger M.; Rokos J., Prochazka P.: The Influence of Chlortetracycline on the Activity of a-amylase 105
Dostrilek 1VI., Spurny M.: Characteristics on Culturing of Sulphate Reducing Bacteria fi?om Oil
Deposits 158
Drobnik J.: Splitting of Asparagin by the Enzymatic Complex of Soils 47
Dyr J., Protiva J.: Products of Metabolism during the Growth of Clostridium acetobutylicum 151
Chaloupka J.: Proteolytic Enzymes of Actinomyces Streptomyces griseus. II. The Influence of the
IQature and Concentration of Nitrogen o:x the Secretion of Protease 32
Chaloupka J.: Proteolytic Enzymes of the Actinomyces Streptomyces griseus. III. Short-term
Production of the Enzyme : 241
Johanovsky J.: The Phenomenon of Resistance in the Course of Experimental Staphylococcal
Infection. I. 16
Johanovsky J.:. The Phenomenon of Resistance in the Course of Experimental Staphylococcal
Infection. II. 111
Kalina ~., Padevgt M.: A New Method of Staining Micro-organisms 184
Kockova-Kratochvflova A., Gebauerova A., Hrdinova M.: Study of the Harden Young Effect
in Yeasts. I. 247
Mb,lek I.: Development of the Czechoslovak Microbiology 1
Marha K., Miiller J.: An Evaluation of tho Growth Curves of L+'scherichia soli 135
Matelov~ V., Necasek J.: The Significance of Fermentation Conditions for the Production of
Penicillui by the Strain Penicillium chrysogenum 61-20 255
~ehricek Z.: lletermination of the ilTUmber of Spores of Sporulating Actinomyces in the Soll and
Their Isolation 129
l~ehaeok Z.: Spreading of Actinomyces in the Rhizosphere of Some Grains 211
I~iha L, l~ihods; L.: The Influence of Antibodies in the. Culture Medium on the Growth of Salmonella
paratyphi B 59
Seifert J.: Microbiological Processes and the Catalytic Power of Soil - 74
Spurny M., Dost~#lelc M., l~lehla J.: A Method for Evaluating the Sulphate Reducing Bacteria 272
Starka J., Z~,vada J.: The Relationship between Metaphosphate and Volutin Formation in Yeast.
Electrophoretic Separation of Phosphorylated Compounds Traced with P32 70
Svoboda M., ~`alplachta J.: Some Observations on the Cleansing of Dairy Sewage by Means of
Oospora lactis . 176
. .
Szrinto J.: Titration of the Influenza Virus in Tissue Cultures 41
Szanto J., Valentova N.: The Dynamics of Reproduction of the Influenza Virus in 'Tissue Cultures
in Roller Tubes 227
. .
.`Sevcfk V., Podojil M., Kyselovti M., Vrtiskova A.: The New Antibiotic BU 2 71 223
~evefk V., Podojil M., Kyselova M., Vrtiskovzi A.: The New Antibiotic BU 30G 263
~illxtxnkovfi~ L .: Selective Inhibition of Rough Forms of Yeasts 204
~terzl J.: Long-term Immunisation. I. The Inhibition of Antibody Formation in Daily Immunisation 7
`Sterzl J.: Long-term Immunisation. II. Changes in the Peritoneal Exsudate, Leucocytic and
Temperature Reactions . 1.G5
~terzl J., Kr~,lilc O.: A Method of Micro-interval Immunisation 1.39
Trnka Z.: The Influence of Protein Deficiency and Excess in the Diet on Immunity Response.
I. Short-term Administration of Diets . 49
Trnka Z.: The Influence of Protein Deficiency and Excess in the Diet on Immunity Response.
II. Long-term Administration of Diets 123
Tflehla J., Spurny M., Dostalek M.: Biological Sulphate Reduction as Studied by means of the Spot
Test Reaction for Hydrogon Sulphide 2G7
Vinter V.: Sporulation of Bacilli. II. Proteolytic Enzymes in the Process of Sporulation of Bacillus
megatherium G3
. .
Vinter 1'.: Sporulation of Bacilli. III. Transference of Calcium to Cells and Decrease in Proteolytic
Activity in the Medium in the Process of Sporulation of Bacillus megatherium . 145
Weiser J., Lysenko O.: Silk-worm Septicaemia .. 216
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Upozorni~ni ctenaii'um.
Redakco casopisu ?British Abstracts of Medical Sciences" nas poz~dala, abychom upozornili ctona-
ie, ze n{~zov tohoto ~aeopisu byl zmi3n~n na
?International Abstracts of~Biological Sciences".
Tato zmena souvisi s tim, ze bode rozafi?en okruh biologickych oborti, kter? jsou v casopiso abstraho-
vt~ny, a ze tento Zasopis hudo spolupracovat se sov~tskymi itasopisy ?Referativnyj zurnfi,l biologii"
a ?Roferativnyj zurnal biologiceskoj chimii". ?International Abstracts of Biologicn?1 Sciences" printitii
abstrakty ze vaecH oboru biologie.
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
 Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9
Piehled c"asopisu vydavanych Ceskoslovenskou akademii zemedelskych ved
v Letosnim rote.
Sbornik CSAZV - Veterinarni medicina
(vychazi 12krat rocne, rozsah 80 strap, pr"edplatne 120 Kcs)
Sbornik CSAZV - Historie a musejnictvi
(vychazi 4krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 40 Kcs)
Sbornik CSAZV - Mechanisace a elektrifikace zemede"lstvi
(vychazi 5krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 60 Kcs)
Sbornik CSAZV - Zemede"lska ekonomika
(vychazi 6krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 60 Kcs)
Sbornik CSAZV - Rostlinn~ vyroba
(vychazi 12krat rocne, rozsah 112 strap, predplatne 168 Kcs )
Sbornik CSAZV - Zivocis"na vyroba
(vychazi 12krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 17.0 Kcs)
Sbornik CSAZV -Lesnictvi \
(vychazi 12krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 120 Kcs)
Vestnik CSAZV
(vychazi 12krat rocne, rozsah 56 strap, predplatne 96 Kcs)
Za socialisticke zemede"lstvi
(vychazi 24krat rocne, rozsah 64 strap, predplatne 60 Kcs)
Sovetske zemede"lstvi
(vychazi 6krat rocne, rozsah 160 strap, predplatne 30 Kcs)
Sovetske Lesnictvi
(vychazi 6krat rocne, rozsah 80 strap, predplatne 24 Kcs)
Piehled zahranicni zemedelske a lesnicke literatury
(vychazi 12krat rocne, rozsah 96 strap, pr"edplatne 180 Kcs)
Piehled ceskoslovenske zemede"lske a lesnicke literatury
(vychazi 12krat rocne, rozsah 32 strap, predplatne 60 Kcs)
Nove knihy zemedeelskych knihoven
(vychazi 12krat rocne, rozsah 16 strap, s pravidelnou prilohou ?Prameny
literatury" predplatne 36 Kcs)
Ceskoslovenska akademie zemedelskych ved, administrate casopisu, Praha XII,
Slezska 7
Approved For Release 2008/04/10 :CIA-RDP80T00246A002900500006-9